苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷機(jī)理及有效成分研究

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苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷機(jī)理及有效成分研究

周傳鐸　吳軍　劉鐘杰　索占偉　穆祥　李禹濤　段惠琴 （1　中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京　100094；2　北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技系，北京 102206） 　　志賀樣毒素Ⅱ型變異體(Shiga like toxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大腸桿菌(EHEC)產(chǎn)生，為豬水腫病的主要毒力因子。試驗(yàn)研究表明，SLT-Ⅱe能抑制大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells, RIMMVECs）的增殖，并可對(duì)其造成一定損傷。而適宜苦參水煎液不但可以促進(jìn)RIMMVECs增殖，更可以減弱SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs的損傷。本試驗(yàn)通過對(duì)苦參水煎液及其主要成分與SLT-Ⅱe共同作用于RIMMVECs后，不同時(shí)間段細(xì)胞上清夜中NO、ET-1分泌量的檢測(cè)，旨在從細(xì)胞水平探尋苦參抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs的損傷機(jī)理，并對(duì)其有效成分進(jìn)行研究，為中藥對(duì)抗細(xì)菌毒素及防治細(xì)菌病的研究提供理論基礎(chǔ)。 　　1　材料與方法 　　1.1　材料 　　DMEM（Gibico）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）；大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（北京農(nóng)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供）；NO試劑盒（深圳晶美）；ET-1（內(nèi)皮素-1）試劑盒（北京尚柏生物公司）；噻唑藍(lán)（MTT，Amresco）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；所有試劑均經(jīng)過0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。 　　1.2　儀器 　　培養(yǎng)板（Costar）；96孔酶標(biāo)板（Costar）；CO2培養(yǎng)箱（Sanyo)；熒光倒置數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BioRad）；分光光度計(jì)(UNICO) 　　1.3　方法 　　1.3.1　細(xì)胞傳代接種：選取第10代的細(xì)胞進(jìn)行消化，所得細(xì)胞液用完全培養(yǎng)基稀釋，將細(xì)胞密度調(diào)整到5×104 ?個(gè)/mL，充分混勻后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔接種200 μl，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。 　　1.3.2　分組方案：共分5組，每組5個(gè)重復(fù)（其中12 h 各細(xì)胞組在一塊細(xì)胞培養(yǎng)板上）。分組及各組毒素與中藥液終濃度如下。空白組：維持培養(yǎng)基；毒素組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 含量為10.0 μg/m；毒素+苦參水煎液組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦參200.0 μg/mL；毒素+苦參堿組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，苦參堿200.0 μg/mL；毒素+氧化苦參堿組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，氧化苦參堿200.0 μg/mL 　　1.3.3　NO、ET-1的測(cè)定：將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%鋪滿培養(yǎng)孔底壁。如分組劑量更換培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)的3、6、9、12 h，從各大組中選取一個(gè)小組的5個(gè)孔，吸出全部細(xì)胞培養(yǎng)液250 μl，3000 rpm離心10 min后，將上清液移入新的小離心管中，封口，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。依試劑盒說明書完成細(xì)胞上清液中NO、ET-1的測(cè)定，其中ET-1每組3個(gè)重復(fù)。 　　1.3.4　12h增值率的測(cè)定：在12 h后，將12 h組的各孔細(xì)胞上清夜吸凈后，加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150 ml的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞增殖率（OD值）。 　　1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，試驗(yàn)組間差異采用t檢驗(yàn)法。 　　2．結(jié)果 　　2.1　苦參水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs增殖作用 由表1可以看出，當(dāng)SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時(shí)，毒素作用RIMMVECs 12 h后，MTT法測(cè)細(xì)胞增殖率OD值與空白對(duì)照組比較明顯降低，且差異極顯著。而毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組在12 h時(shí)的OD值均顯著高于毒素組，其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較無(wú)顯著差異，而毒素+氧化苦參堿組與空白組比較差異極顯著，與毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較差異亦極顯著。 　　表1　苦參水煎液及其成份抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs增殖作用( n = 5 ) 組別 X ± S 增殖率% 統(tǒng)計(jì)結(jié)果 空白組 2.88±0.12 — A?? a 毒素組 2.32±0.07 -19.53 C?? c 毒素+苦參水煎液組 2.79±0.06 -2.95 A?? a 毒素+苦參堿組 2.80±0.07 -2.61 A?? a 毒素+氧化苦參堿組 2.56±0.04 -10.91 B?? b 　　注：各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　2.2　苦參水煎液及其成份對(duì)SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影響 　　由表2可以看出，空白組NO分泌量隨著時(shí)間的增加而增加，呈逐漸上升的趨勢(shì)，且上升趨勢(shì)平緩。而毒素組，除在3h時(shí)，NO分泌量與空白組沒有明顯差異，在6h、9h、12 h時(shí)均較空白對(duì)照組明顯升高，且差異極顯著。而在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，三個(gè)中藥組毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組的NO分泌量均落在毒素組與空白組之間。3 h時(shí)，各個(gè)組NO分泌量間沒有明顯差異。在6 h時(shí)，三個(gè)中藥組NO分泌量與毒素組比較，差異極顯著；其中，毒素+苦參堿組與空白組比較差異顯著。在9 h時(shí)，三個(gè)中藥組NO分泌量與毒素組比較，差異極顯著；其中毒素+氧化苦參堿組與空白組比較差異極顯著。12 h時(shí)，三個(gè)組與毒素組比較，差異極顯著，其中毒素+氧化苦參堿組與空白組差異極顯著。三者間比較，除在12 h時(shí)，毒素+苦參堿組與毒素+氧化苦參堿組間差異顯著外，其他均無(wú)顯著差異。 表3-12　苦參水煎液及其成份SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌NO的影響（X±S μmol/L，n = 5） 組別 3 h 6 h 9 h 12h 空白組 9.45±1.54 A a 11.71±0.72 B c 13.10±1.63 Cc 15.11±1.67 C d 毒素組 10.08±1.61 A a 17.13±1.75 A a 18.14±1.21 A a 23.05±2.30 A a 毒素+苦參水煎液組 9.70±1.00 A a 12.59±1.26 Bbc 14.61±1.29 BCbc 17.88±1.70 BCbc 毒素+苦參堿組 9.95±1.13 A a 13.60±1.14 B b 14.11±0.84 BCbc 16.75±1.70 BCcd 毒素+氧化苦參堿組 9.82±1.31 A a 12.97±1.38 Bbc 15.87±1.50 AB b 19.40±0.93 B b 　　注：相同時(shí)間的組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　2.3　苦參水煎液及其成份對(duì)SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影響 　　由表3可以看出，而對(duì)于ET- 1的分泌量，空白組隨著時(shí)間的增加而沒有明顯變化。毒素組，在3h時(shí)，ET-1分泌量與空白組比較明顯降低，且差異極顯著。而在6h、9h、12h時(shí)，毒素組ET-1又明顯上升，與空白對(duì)照組比較差異極顯著。對(duì)于中藥組，在3 h時(shí)，毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組的ET-1分泌量均高于毒素組，且差異極顯著；其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組與空白組比較差異極顯著。三者間比較，毒素+氧化苦參堿組與其他兩組比較差異極顯著。從6 h后，三個(gè)中藥苦參組ET-1的分泌量即落在毒素組與空白組之間。在6 h時(shí)，三個(gè)組ET-1分泌量與毒素組和空白組比較，差異均極顯著。三者間比較差異都極顯著。在9 h時(shí)，三個(gè)中藥組ET-1分泌量與毒素組和空白組比較，差異均極顯著。三者間比較，毒素+氧化苦參堿組與其他兩組比較差異極顯著。12 h時(shí)，三個(gè)中藥組ET-1分泌量與空白組比較，差異極顯著；其中毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組ET-1分泌量與毒素組比較，差異極顯著。三者間比較差異都極顯著。 表3-13　苦參水煎液及其成份對(duì)SLT-Ⅱe引起RIMMVECs分泌ET-1的影響（X±S pg/mL，n = 3） 組別 3 h 6 h 9 h 12 h 空白組 1.73±0.12 B b 1.99±0.11 E e 2.06±0.15 D d 2.01±0.14 D a 毒素組 0.90±0.11 C c 6.62±0.14 A a 7.10±0.16 A a 6.62±0.21 A a 毒素+苦參水煎液組 2.09±0.14 A a 5.18±0.20 C c 5.18±0.15 C c 5.13±0.21 B b 毒素+苦參堿組 2.16±0.14 A a 4.69±0.11 D d 4.97±0.23 C c 3.88±0.11 C c 毒素+氧化苦參堿組 1.71±0.11 B b 5.77±0.07 B b 5.99±0.14 B b 6.36±0.11 A d 　　注：相同時(shí)間的組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05 　　3　分析與討論 　　本實(shí)驗(yàn)用MTT法觀察SLT-Ⅱe對(duì)RIMVECs增殖的影響。從細(xì)胞增值率的角度出發(fā)，毒素＋中藥組中，在毒素+苦參水煎液組、毒素+苦參堿組、毒素+氧化苦參堿組在12 h時(shí)的OD值均顯著高于毒素組。表明在12 h時(shí)，200 μg/mL的苦參水煎液、苦參堿、氧化苦參堿對(duì)SLT-Ⅱe引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷均起到了保護(hù)作用，降低由毒素引起的增殖抑制。 　　NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的內(nèi)皮衍生性舒張因子，具有很強(qiáng)的舒血管功能[1]。ET-1是迄今為止已知最強(qiáng)的血管收縮性物質(zhì)[2]。二者相互作用，維持血管的舒縮及通透性。試驗(yàn)結(jié)果表明，10 μg/mL的SLT-Ⅱe在作用于RIMMVECs后，首先表現(xiàn)出在3 h時(shí)ET-1分泌量顯著下降，NO無(wú)明顯變化。而在6 h后，NO與ET-1較空白組均顯著升高。其原因可能是由于毒素作用細(xì)胞后，首先引起ET-1的迅速降低，從而導(dǎo)致NO、ET-1比例失衡，血管迅速擴(kuò)張，致使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，而后NO持續(xù)生成，并轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)細(xì)胞毒性的ONOO－，從而加劇了細(xì)胞的損傷與死亡[3]。而200 μg/mL的苦參水煎液可在3 h時(shí)明顯抑制因毒素作用所致的細(xì)胞上清液中ET-1的降低，并在3 h、6 h、9 h、12 h時(shí)不同程度的降低了毒素作用后細(xì)胞上清液中NO的分泌量，維持了NO與ET-1在細(xì)胞外環(huán)境的平衡，從而減輕了毒素對(duì)細(xì)胞的損傷作用?？鄥煞N主要成分苦參堿和氧化苦參堿對(duì)NO、ET-1的作用趨勢(shì)與苦參水煎液基本相同。在12 h時(shí)苦參堿對(duì)RIMMVECs的增殖效果來(lái)看略高于苦參水煎液組，但極顯著高于氧化苦參堿組。而其在對(duì)ET-1及NO的調(diào)控作用也好于氧化苦參堿組，故在200 μg/mL濃度條件下，苦參堿在苦參對(duì)抗SLT-Ⅱe保護(hù)RIMMVECs的功效中發(fā)揮主要作用。 　　綜上所述， SLT-Ⅱe作用細(xì)胞后可在短時(shí)間內(nèi)引起ET-1的迅速降低，從而導(dǎo)致NO、ET-1比例失衡，血管迅速擴(kuò)張，致使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，NO分泌量開始逐漸增加。而隨著NO量的增加，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的損傷。而苦參則在SLT-Ⅱe作用最初階段抑制ET-1的降低、維持NO、ET-1比例平衡，在后期降低NO的分泌量，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。其中苦參堿較之氧化苦參堿保護(hù)效果更為突出。