穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO及ET-1的影響

貔貅

志賀樣毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）是豬水腫病（ED）的主要致病因子[1,2]。目前的研究顯示：SLT-Ⅱe致病機(jī)制是通過對(duì)其靶細(xì)胞-——腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，引發(fā)細(xì)胞分泌機(jī)能的改變，釋放各種細(xì)胞因子影響細(xì)胞的正常形態(tài)和功能[3]。NO與ET-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一對(duì)作用相反的因子，分別有舒張和收縮血管的作用[4,5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過調(diào)控NO與ET-1的釋放平衡來調(diào)節(jié)血管的功能[6]。

　　穿心蓮內(nèi)酯為爵床科植物穿心蓮的有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)血管舒縮[7]、抗血栓及血小板聚集[8]等多種作用，對(duì)機(jī)體內(nèi)微循環(huán)的調(diào)節(jié)具有重要意義。本試驗(yàn)旨從大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMMVECs）分泌NO與ET-1的角度，探討SLT-Ⅱe具體的致病機(jī)制以及穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe損傷RIMMVECs的作用機(jī)制。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　DMEM（Gibico）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe粗提物（揚(yáng)州大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供）；穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）；NO試劑盒（深圳晶美公司）；ET-1試劑盒（上海尚柏生物公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)

　　選取第10代的細(xì)胞進(jìn)行消化, 所得細(xì)胞液用完全培養(yǎng)基稀釋,將細(xì)胞密度調(diào)整到5 ×104 個(gè)?mL-1, 充分混勻后接種至96孔的培養(yǎng)板中,每個(gè)孔接種0.2 mL，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。

　　1.2.2試驗(yàn)前細(xì)胞計(jì)數(shù)

　　培養(yǎng)48h 后，定時(shí)消化三孔細(xì)胞作計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增至1×105 個(gè)?mL-1 時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.3分組方案

　　各孔細(xì)胞分為空白對(duì)照組、SLT-Ⅱe組、SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組和SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組?？瞻讓?duì)照組加DMEM維持培養(yǎng)基，其余三組加含有10 μg?mL-1 SLT-Ⅱe的DMEM維持培養(yǎng)基，2 h后再向SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組和SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組分別加入終濃度為5 μg?mL-1、20 μg?mL-1的穿心蓮內(nèi)酯液，置于CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

　　1.2.4取樣

　　每組分6 h、12 h、18 h三個(gè)觀測(cè)點(diǎn)，在各時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定細(xì)胞上清液中NO和ET-1的含量。

　　1.2.5測(cè)定

　　NO的測(cè)定用硝酸還原酶法,按照試劑盒說明操作,使用分光光度計(jì)于530 nm 處檢測(cè)。

　　ET-1的測(cè)定用ELISA法，按照試劑盒說明操作，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測(cè)。

　　1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

　　采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

　　試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，試驗(yàn)組間差異采用t檢驗(yàn)法。

　　2結(jié)果

　　2.1不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響

　　表1　不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs分泌NO的影響（治療組）（±S μmol?L-1）(n＝3)

組別	6 h	12 h	18 h
空白對(duì)照組	12.82±1.75	14.73±2.84	16.45±2.31
SLT-Ⅱe組	16.45±0.88	19.50±3.19	32.68±2.29**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組	15.49±2.30	21.22±2.06**	31.34±2.82**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組	17.02±3.26	15.69±2.32	16.25±4.8△

　　注：與空白組對(duì)照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe組與SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組，SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯
　　2組對(duì)照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。
　　2.2不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs分泌ET-1的影響
　　表2 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯抗SLT-Ⅱe對(duì)RIMMVECs分泌ET-1的影響（治療組）（±S pg?mL-1）(n＝3)
　　

組別	?6 h	12 h	18 h
空白對(duì)照組	1.33±0.55	2.32±0.45	2.91±0.61
SLT-Ⅱe組	10.27±1.21**	9.56±1.41**	8.35±0.89**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組	10.31±0.81**	9.93±1.33**	7.71±0.59**
SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組	12.47±1.19**△△	13.08±0.53**△△	13.67±0.61**△△

　　注：與空白組對(duì)照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe組與SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組、SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯
　　2組對(duì)照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。
　　3討論
　　NO與ET-1之間均以cGMP 為中介，兩者之間存在著反饋性調(diào)節(jié)[9]，共同維持著正常的血管舒縮。兩者分泌量一旦發(fā)生紊亂，勢(shì)必破壞機(jī)體內(nèi)正常微循環(huán)的進(jìn)行。由表1和表2看出，SLT-Ⅱe組中NO的分泌量?jī)H僅在第18 h極顯著高于空白組，在第6、12 h與空白組無顯著差異；ET-1在第6、12、18 h與空白組相比均極顯著升高。分析原因可能是，微血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到SLT-Ⅱe刺激后，通過自身的保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用，ET-1首先開始分泌，以抑制NO—cGMP途徑，使NO的分泌量在12 h內(nèi)未顯著升高，細(xì)胞內(nèi)的cGMP 水平也未明顯升高。作用一段時(shí)間后，SLT-Ⅱe逐漸發(fā)揮毒性作用，而細(xì)胞自身的保護(hù)力逐漸下降，出現(xiàn)了失代償?shù)臓顩r，ET-1逐漸無法遏制NO的合成，NO大量分泌，ET-1反被NO抑制，分泌量呈逐漸下降的趨勢(shì)。NO在18 h達(dá)到分泌高峰，并通過NO—cGMP 途徑，使細(xì)胞內(nèi)的cGMP 水平增高而導(dǎo)致血管舒張，進(jìn)而使機(jī)體發(fā)生水腫。由此我們認(rèn)為，SLT-Ⅱe致病機(jī)制主要是作用其靶細(xì)胞——微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞通過自身保護(hù)力首先分泌ET-1來抑制NO分泌量的升高，但最終毒素的持續(xù)作用使細(xì)胞失去自身保護(hù)力，NO大量分泌導(dǎo)致微血管舒張，間隙增大，組織液進(jìn)入組織間隙的量增多，造成組織水腫。在SLT-Ⅱe的致病機(jī)制中，NO是主要的致病因子，而ET-1作為與NO作用相反的細(xì)胞因子，在一定程度上可能起著保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　穿心蓮內(nèi)酯目前已經(jīng)成為抗心血管疾病常用中藥之一。有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)血管舒縮的作用[10]。由表1和表2可以看出，SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯1組（5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯）中NO的分泌量逐漸升高，且在12、18 h高于空白組，差異極顯著，較SLT-Ⅱe組差異不顯著；ET-1分泌量各時(shí)間段均較空白組高，且呈略微下降趨勢(shì)，較SLT-Ⅱe差異均不顯著。分析原因可能是，5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯對(duì)SLT-Ⅱe作用后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)力較弱或沒有保護(hù)力。5 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯作用后，微血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速分泌ET-1，但是ET-1的分泌量較SLT-Ⅱe組沒有顯著的升高，無法抑制NO—cGMP 途徑，NO大量分泌，cGMP水平升高從而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。SLT-Ⅱe＋穿心蓮內(nèi)酯2組（20 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯）中NO分泌量略有降低，在各時(shí)間段與空白組均無顯著差異，而在18 h顯著低于SLT-Ⅱe組；ET-1分泌量略有升高，各時(shí)間段極顯著高于空白組，且極顯著高于SLT-Ⅱe組。分析原因可能是，20 μg?mL-1可以使ET-1在18 h內(nèi)均保持較高的分泌量，抑制了NO—cGMP 途徑，使NO無法大量分泌，且分泌量能夠回復(fù)到生理狀態(tài)時(shí)的水平，進(jìn)而起到保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。近年來穿心蓮內(nèi)酯對(duì)心血管方面的藥理研究很多，但試驗(yàn)多以主動(dòng)脈、臍靜脈等為研究對(duì)象，對(duì)微血管方面的藥理作用研究甚少。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，不僅僅是對(duì)大動(dòng)脈、大靜脈，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)機(jī)體的微血管同樣有一定的調(diào)節(jié)作用。雖然具體的作用機(jī)制尚不清楚，但基本上可以認(rèn)定，穿心蓮內(nèi)酯是通過刺激細(xì)胞分泌對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用的ET-1，來抑制SLT-Ⅱe刺激后分泌的主要的致病因子——NO的合成，從而達(dá)到治療效果。這一結(jié)論再次驗(yàn)證了之前“在SLT-Ⅱe的致病機(jī)制中，NO是主要的致病因子，ET-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有一定的保護(hù)力”的推測(cè)。
　　綜上所述，NO分泌量的升高是SLT-Ⅱe引起腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的直接因素。微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到 SLT-Ⅱe的作用，通過自身的保護(hù)機(jī)制，首先使ET-1快速升高，以抑制初期NO分泌量的升高，隨后NO開始大量分泌而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此外，在18 h時(shí)間段內(nèi)，20 μg?mL-1穿心蓮內(nèi)酯可以使SLT-Ⅱe作用后的ET-1保持穩(wěn)定的分泌，NO分泌量不顯著升高，從而對(duì)SLT-Ⅱe所致微血管損傷及微循環(huán)的障礙起到一定的治療作用。