SLT-2e對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO的影響

貔貅

志賀樣毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）是豬水腫病（ED）的主要致病因子[1]。目前的研究顯示：SLT-Ⅱe的致病機制是通過對其靶細胞-——腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的刺激，引發(fā)細胞分泌機能的改變，釋放各種細胞因子影響細胞的正常形態(tài)和功能[2]。NO是血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮衍生性舒張因子，具有抗血小板聚集和中性粒細胞黏附的作用，對機體的微循環(huán)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[ 3 ]。　　為了研究微血管內(nèi)皮細胞在豬水腫病發(fā)病機制中的作用，本試驗以大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞為介質(zhì)，觀察了SLT-Ⅱe對其分泌細胞因子NO的影響，旨在了解SLT-Ⅱe對腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的損傷機制。
　　1材料與方法
　　1.1材料
DMEM（Gibico）；標準胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（揚州大學微生物實驗室提供）；大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞（北京農(nóng)學院實驗室提供）；NO試劑盒（深圳晶美公司）。
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞傳代培養(yǎng)
選取傳至第10代的大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞進行消化,所得細胞液用完全培養(yǎng)基稀釋,將細胞密度調(diào)整到5×104 個?mL-1,充分混勻后接種至96孔的培養(yǎng)板中,每個孔接種0.2 mL，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48h。
　　1.2.2試驗前細胞計數(shù)
培養(yǎng)48 h后，定時消化三孔細胞作計數(shù)，當細胞數(shù)量增至1 ×105 個?mL-1 時，用于試驗。
　　1.2.3分組
將各孔細胞分為空白對照組、SLT-2e 1組、SLT-2e 2組、SLT-2e 3組，每孔設(shè)復(fù)孔3個，分別加入含0μg?mL-1、2μg?mL-1、10μg?mL-1、50μg?mL-1SLT-2e的DMEM維持培養(yǎng)基，置于CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
　　1.2.4取樣
每組分6h、12h、18h、24h四個觀測點，在各時間點取樣測定細胞上清液中NO的含量。
　　1.2.5測定
NO的測定用硝酸還原酶法，按照試劑盒說明操作于530nm 處檢測.
　　1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計
試驗結(jié)果采用平均值±標準誤表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理，試驗組間差異采用t檢驗法。
　　2結(jié)果
　　不同濃度SLT-2e對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞NO分泌的影響結(jié)果見表1。由表1可以看出，SLT-2e 1組（2μg?mL-1）在6 h、12 h、18 h和24 h時，NO的分泌量無顯著變化；SLT-2e2組（10μg?mL-1）在12 h、18 h和24 h時，NO分泌量均顯著或極顯著升高；SLT-2e3組（50μg?mL-1）在各時間段均極現(xiàn)狀升高，說明一定濃度的SLT-2e能夠作用于微血管內(nèi)皮細胞，使其分泌NO的量增加。
　　表1. 不同濃度SLT-2e對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞（RIMVECs）分泌NO的影響 (n＝3)

組別	6 h	12 h	18 h	24 h
空白對照組	9.58±0.87	11.29±3.68	12.05±171	11.10±1.44
SLT-2e 1組 (2μg?mL-1)	10.72±1.75	11.86±1.19	10.15±2.87	12.81±2.38
SLT-2e2組（10μg?mL-1）	11.10±3.15	17.40±1.32*	35.93±2.31**	36.11±2.50**
SLT-2e3組（50μg?mL-1）	19.31±4.03**	26.95±2.29**	24.28±4.67**	26.38±5.98**

　　**p＜0.01，*p＜0.05
　　3討論
　　已有研究表明，豬水腫病的致病過程分為3 個階段：（1）致豬水腫病大腸埃希菌感染易感豬；（2）細菌以其F18ab( F107) 菌毛黏附于小腸上皮細胞；（3）細菌在腸道內(nèi)定居和增殖，產(chǎn)生志賀樣毒素Ⅱ型變異體（SLT-Ⅱe）并被吸收，最終導致感染豬發(fā)病[4]。SLT-Ⅱe在本病的發(fā)生過程中起著重要作用，它可通過直接或間接的途徑激活或損傷腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，如血管的舒縮、黏附分子的表達以及屏障功能損傷等[5]。
NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的重要細胞因子之一，具有舒張血管的作用。一旦出現(xiàn)體內(nèi)NO分泌不足或過量，都會對機體微循環(huán)造成嚴重損傷，進而引發(fā)各種疾病[6]。本試驗結(jié)果表明，腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞在生理狀態(tài)下也分泌一定量的NO，以維持微血管內(nèi)皮細胞功能的穩(wěn)定。于培養(yǎng)基中添加一定量的SLT-Ⅱe后，10μg?mL-1 和50μg?mL-1組在6-24 h時，NO分泌量均顯著升高，表明SLT-Ⅱe能夠作用于微血管內(nèi)皮細胞，刺激其對NO的分泌量增加。NO是舒張血管物質(zhì)，其含量的升高，將使血管舒張，血管間隙增加，血管內(nèi)的液體成分更易于滲出到血管外，導致水腫的發(fā)生，這也證明產(chǎn)志賀樣大腸桿菌引起水腫病的機理就是通過其分泌的SLT-Ⅱe作用于腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，致使微血管內(nèi)皮細胞對NO的分泌增加而發(fā)揮致病作用的。
　　從本試驗的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，濃度為50μg?mL-1 的SLT-2e作用于細胞后，NO的分泌量在6 h和12 h即顯著高于10μg?mL-1組，而在18 h和24 h時，則顯著低于，這可能是因為50μg?mL-1 濃度較高，作用于細胞后，在短時間內(nèi)即導致其NO的分泌大量增加，但隨著作用時間的延長，部分細胞因毒素的作用而死亡，因此在18 h和24 h時NO的分泌量反而較10μg?mL-1組為低。由試驗結(jié)果還可以看出，2μg?mL-1組各時間段NO的分泌量始終處于一個比較恒定的水平，其原因可能于本組毒素濃度較低，對微血管內(nèi)皮細胞的損傷較小或沒有損傷有關(guān)。
　　綜上所述，我們認為SLT-2e損傷腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，使其NO分泌增加是仔豬水腫病發(fā)生的機制之一。