豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對動植物細(xì)胞損害作用的對比

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豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對動植物細(xì)胞損害作用的對比 楊鳴琦*，張 黎，顏水泉 (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100)

[摘 要]為了探索豆類絲核菌或其次級代謝產(chǎn)物的動植物損害在細(xì)胞生物學(xué)上的關(guān)系，為苦馬豆素（swainsonine, SW）的毒理學(xué)研究提供新的研究思路。本試驗通過制作豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物污染的飼料和人工污染豆類絲核菌飼料，飼喂家兔17d ,剖檢家兔并取其腦、肝臟、腎臟等組織分別進(jìn)行病理組織學(xué)和電鏡觀察；同時將不同濃度的次級代謝產(chǎn)物和不同株的豆類絲核菌分別污染回接的綠豆，待84h培養(yǎng)后，分別進(jìn)行組織學(xué)和電鏡觀察。結(jié)果在對動植物細(xì)胞損害作用中，豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物使家兔腦組織和淋巴細(xì)胞空泡變性，神經(jīng)細(xì)胞核糖體脫顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等；同時能使植物根部組織結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞空泡變性，內(nèi)膜破裂等。由此表明，豆類絲核菌引起的動物中毒作用主要是其次級代謝產(chǎn)物中SW發(fā)揮毒性，且同瘋草中毒引起的病理變化基本一致；菌株對植物根部的致病性與其次級代謝產(chǎn)物中SW含量呈正相關(guān)。即推測，SW很有可能不僅是動物豆類絲核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物絲核菌病中細(xì)胞損害的主要化學(xué)物質(zhì)。 [關(guān)鍵詞]豆類絲核菌；次級代謝產(chǎn)物；苦馬豆素；毒性 [中圖分類號]：S859.8[文獻(xiàn)識別碼]A     動物的瘋草中毒研究目前報道較多，而且認(rèn)為瘋草中毒的主要毒物是苦馬豆素（swainsonine,SW）[1～3]。SW同時也被認(rèn)為是豆類絲核菌污染飼料引起流涎征的主要成分[4, 5]。楊鳴琦等首次在國內(nèi)分離出的豆類絲核菌，與國外報道的該菌生理、形態(tài)特性相一致，也同時發(fā)現(xiàn)了該菌的植物致病性和所提取的SW的抗腫瘤作用[6,7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌的次級代謝產(chǎn)物中含有大量的SW[8]。但是，運用國內(nèi)分離菌污染飼料是否同樣可引起動物中毒；中毒是菌體本身作用還是該菌的次級代謝產(chǎn)物作用；該菌的植物致病作用是否也同其次級代謝產(chǎn)物和SW相關(guān)；動物中毒與植物致病在細(xì)胞生物學(xué)角度上是否存在一定的關(guān)系，這些疑問目前仍未解決。因此，本試驗?zāi)康脑谟谶\用病理學(xué)方法分析豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對動植物細(xì)胞的損害作用，并將動物中毒與植物致病作用進(jìn)行比較，找到這兩個作用與次級代謝產(chǎn)物及SW的關(guān)系。其意義在于，該試驗對豆類絲核菌的毒性研究更加深入，并對豆類絲核菌引起動植物的毒害作用機(jī)理提供重要依據(jù)。 1材料與方法 1.1 主要儀器AO組織切片機(jī)：WARNER-LAMBERT TECH.INC，美國。JEM-100SX透射電子顯微鏡：日本JEOL公司制造。 XSZ-G型光學(xué)顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠制造。 Coolpix995型數(shù)碼相機(jī)，日本NIKON公司制造。ZPQ-280B智能氣候培養(yǎng)箱：哈爾濱東拓科技開發(fā)有限公司制造。SW-CJ-IF型醫(yī)用潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司制造。1602MP8-1型電子天平（萬分之一）：德國SARTORIUS COTTINGEN公司制造。 1.2主要試劑及其配制 豆類絲核菌：菌株02-6B和94-2B，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物病理學(xué)實驗室提供。次級代謝產(chǎn)物液Ⅰ：將豆類絲核菌 14d發(fā)酵液稀釋為內(nèi)含SW 0.54mg/ml，煮沸滅菌，待用。次級代謝產(chǎn)物液Ⅱ：將豆類絲核菌 14d發(fā)酵液稀釋為內(nèi)含SW 0.14mg/ml，煮沸滅菌，待用。 1.3實驗動物和植物 家兔：購于陜西楊凌周邊農(nóng)村，體重500g左右，共9只，雄性。綠豆：購于陜西楊凌市場。 1.4動物分組     A組：飼喂次級代謝產(chǎn)物組，家兔3只，每天每只定時飼喂含有豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物飼料7g及胡蘿卜、白菜等（每天攝入SW約為14.5mg/Kg·b），飼喂17d。B組：絲核菌污染飼料組，家兔3只，每天每只定時飼喂人工污染豆類絲核菌飼料Ⅱ7g及胡蘿卜、白菜等，飼喂17d。C組：空白組，家兔3只，每天每只飼喂普通飼料7g及胡蘿卜、白菜等，喂17d。 1.5實驗用綠豆與分組 Ⅰ組：空白對照組，將綠豆回接于少氮半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)[3]，共4管。Ⅱ組：將綠豆回接于培養(yǎng)基的同時，在培養(yǎng)基中接種菌株02-6B，共4管。Ⅲ組：將綠豆回接于培養(yǎng)基的同時，在培養(yǎng)基中接種菌株94-2B，共4管。Ⅳ組：將綠豆回接于含有高濃度次級代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基中（含SW 270mg/L），進(jìn)行培養(yǎng)，共4管。Ⅴ組：將綠豆回接于含有低濃度培養(yǎng)基中（含SW 70mg/L），進(jìn)行培養(yǎng)，共4管。Ⅵ組：將綠豆回接于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，滴加次級代謝產(chǎn)物液高濃度0.4ml（含SW 72mg/L）后繼續(xù)培養(yǎng)。Ⅶ組：將綠豆回接于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，滴加低濃度次級代謝產(chǎn)物液0.4ml（含SW 18.67mg/L）后繼續(xù)培養(yǎng)。 1.6中毒家兔的組織學(xué)與電鏡觀察     將各組家兔于試驗的第17d后處死，取血液并涂片，瑞氏染色，于1000倍油鏡下觀察淋巴細(xì)胞。將小腦、大腦、心臟、脾臟、腎臟用10％中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4μm光學(xué)顯微鏡觀察。取大腦、小腦及肝組織用2.5％戊二醛固定，制作超薄切片，片厚300?，通過透射電子顯微鏡觀察，并記錄。 1.7回接綠豆試驗及其組織學(xué)與電鏡觀察     在無菌條件下，將綠豆用0.1％HgCl2浸泡5min,無菌水沖洗6次，再將綠豆放于含有無菌水的滅菌平皿中，于25℃普通溫箱培養(yǎng)，每隔24h換水一次。于培養(yǎng)3d時將已發(fā)芽的綠豆分別接種于各組試管中，并在光照氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：白天5：00～19：00（14h），25℃，4級光照度；夜間19：00～5：00（10h），20℃，無光照。共計培養(yǎng)48h；48h后按照白天5：00～19：00（14h），22℃，4級光照度；夜間19：00～5：00（10h），15℃，無光照。共計培養(yǎng)36h。將回接培養(yǎng)完畢后的各組豆苗進(jìn)行大體觀察、照相；并將各組豆苗中病變部位取樣用FAA固定液抽氣固定，進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚10μm，番紅－固綠染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，記錄。另取培養(yǎng)后豆苗病變組織用4％戊二醛抽氣固定，制作超薄切片，片厚600?，用透射電子顯微鏡觀察，并記錄。 2結(jié)果 2.1家兔中毒試驗結(jié)果     家兔病變組織光學(xué)顯微鏡觀察,A、B兩組家兔，經(jīng)17d培養(yǎng)后，血涂片中淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)輕度空泡變性，C組血涂片中未見異常。A、B兩組小腦浦肯野氏細(xì)胞空泡變性，并出現(xiàn)衛(wèi)星化及噬神經(jīng)現(xiàn)象；大腦有個別神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、衛(wèi)星化現(xiàn)象，并有小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的空泡變性（見照片1）；毛細(xì)血管周圍水腫；腎間質(zhì)瘀血，腎小管顆粒變性；肝臟瘀血，顆粒變性，個別動物出現(xiàn)脂肪變性；此外，心肌顆粒變性及膽管增生，并以第A組更為明顯。     家兔病變細(xì)胞電鏡觀察,A組腦組織中神經(jīng)細(xì)胞皺縮，密度增大，個別神經(jīng)細(xì)胞腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫顆粒（見照片2），腦組織血管內(nèi)皮水腫；B組中腦組織除以上情況外，還可見吞噬細(xì)胞溶酶體增多，出現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象。A、B兩組肝組織竇內(nèi)出現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞，毛細(xì)膽管擴(kuò)張，肝細(xì)胞線粒體散在存在，且糖原增多，肝臟枯否氏細(xì)胞溶酶體增多。 2.2回接綠豆試驗結(jié)果     大體觀察，Ⅱ～Ⅶ組豆苗中根部均有不同程度出現(xiàn)褐斑、萎縮，其中Ⅳ組豆苗生長完全抑制，根部只有主根無須根，且主根萎縮，潰爛，顏色變褐。除Ⅳ組外，在褐斑等病變程度上Ⅱ、Ⅵ組病變程度較Ⅲ組和Ⅴ組嚴(yán)重，而Ⅶ組病變程度最輕，幾乎無病變與Ⅰ組（對照組）情況接近。     光學(xué)顯微鏡觀察，Ⅱ～Ⅶ組豆苗根部橫斷切片中表現(xiàn)為疏導(dǎo)組織、導(dǎo)管或篩管中有侵填體產(chǎn)生，部分出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損，細(xì)胞壞死。在病變程度上Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ三組侵填體產(chǎn)生較多，維管束病變程度大，細(xì)胞壞死數(shù)量多，而Ⅲ、Ⅴ組相對病變程度較輕；Ⅶ組病變程度最輕，與大體觀察結(jié)果相一致。     透射電鏡觀察，Ⅱ～Ⅶ組根部細(xì)胞多表現(xiàn)為空泡變性，細(xì)胞壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，由此細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂或線粒體游走并進(jìn)入液泡中（見照片3）。而Ⅳ組則表現(xiàn)為廣泛的細(xì)胞壞死（見照片4）。Ⅵ組還表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)膜破裂，葉綠體固縮、顏色加深及葉綠體空泡變性。 3討論 3.1豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對家兔的毒性作用     在本次試驗中，經(jīng)飼喂含有豆類絲核菌（A組）或其次級代謝產(chǎn)物（B組）的飼料17d，均未出現(xiàn)臨床癥狀，但經(jīng)病理組織學(xué)及電鏡觀察，家兔的腦、肝、腎、血都有不同程度的細(xì)胞病變，而淋巴細(xì)胞、小腦浦肯野氏細(xì)胞及大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞的空泡變性，則與家畜瘋草中毒的病理學(xué)變化相同，而且表明該次級代謝產(chǎn)物或真菌的中毒主要是由SW引起的，并且再一次表明SW引起的動物中毒具有一定的貯積作用，屬于慢性中毒，并與國外在瘋草中研究SW的中毒表現(xiàn)是一致的[3]。而A、B兩組雖然A組為直接運用含SW的次級代謝產(chǎn)物，B組為人工污染豆類絲核菌，但在家兔中毒中病理學(xué)變化來看是基本一致的，它不但表明該菌污染飼料和國外報道的[9～11]豆類絲核菌引起動物的中毒相似，而且還表明豆類絲核菌污染引起動物中毒主要是由其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物所引起的。此外，在病理組織學(xué)變化中腦組織毛細(xì)血管水腫，腎小管顆粒變性，心肌顆粒變性及肝臟瘀血、顆粒變性等則同樣與文獻(xiàn)[12～14]中家兔、羊、小鼠的瘋草中毒表現(xiàn)相似，也同樣表明SW除了對以腦組織為主的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行損害外，還能對心、肝、腎等重要器官的組織細(xì)胞進(jìn)行損害。     結(jié)合電鏡觀察結(jié)果，神經(jīng)細(xì)胞的皺縮、細(xì)胞密度增大及組織學(xué)和電鏡中均觀察到的噬神經(jīng)現(xiàn)象表明，該次級代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒害作用，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞體內(nèi)的重要的蛋白質(zhì)合成器官，上面附著的核糖體則主要產(chǎn)生分泌型蛋白質(zhì)及膜表面的功能及構(gòu)型蛋白質(zhì)，而神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及核糖體的脫顆粒，則表明這些神經(jīng)細(xì)胞的損傷與壞死與其蛋白質(zhì)合成代謝障礙有關(guān)，特別是膜表面的蛋白質(zhì)合成受到影響，而膜表面蛋白除了起到結(jié)構(gòu)蛋白的作用外，還是多種離子與營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)耐ǖ?，因此推測含有SW的次級代謝產(chǎn)物可使整個神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)代謝造成紊亂。此外，在電鏡觀察中還發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的增多，這可能與SW的α-甘露糖苷酶抑制作用有關(guān)，從而導(dǎo)致部分合成的低聚糖及糖蛋白在溶酶體內(nèi)的聚積，即導(dǎo)致機(jī)體的溶酶貯積病。腦中毛細(xì)血管周圍的水腫則表明腦組織中低聚糖增加，引起了組織滲透平衡紊亂。同時，SW還可能發(fā)揮有影響機(jī)體能量代謝的作用，即表現(xiàn)在肝細(xì)胞的線粒體減少而糖元的增多上。     由此可見，豆類絲核菌引起的動物中毒作用主要是其次級代謝產(chǎn)物發(fā)揮毒性，而其中主要以SW的作用為主，并且同瘋草中毒引起的病理變化基本一致。而SW在中毒中發(fā)揮的作用不但影響了機(jī)體中其靶細(xì)胞的物質(zhì)運輸，同時還影響細(xì)胞的能量代謝，從而導(dǎo)致細(xì)胞病變。 3.2豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對綠豆苗的致病作用     從大體觀察看，無論是直接接種豆類絲核菌還是通過不同方式直接運用其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，植物根部均能表現(xiàn)出褐斑及潰爛，而在高濃度次級代謝產(chǎn)物組（含SW 270mg/L）中豆苗的生長完全受到抑制。由此可以看出，該菌的植物致病作用和動物中毒相似仍然是次級代謝產(chǎn)物發(fā)揮主導(dǎo)作用。在組織學(xué)觀察中，Ⅱ～Ⅶ組中均有不同程度的維管束病變，植物的疏導(dǎo)組織、導(dǎo)管或篩管均有侵填體產(chǎn)生，并伴有部分細(xì)胞的破損、壞死，從而表明，該代謝產(chǎn)物導(dǎo)致植物的水分和營養(yǎng)物質(zhì)運輸受阻。而在Ⅳ～Ⅶ組中，無論何種方式在培養(yǎng)基中添加次級代謝產(chǎn)物，隨著該次級代謝產(chǎn)物濃度的增加（SW濃度的增加），病變程度越重，侵填體越多。即表明該代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中的濃度與病變程度呈正相關(guān)。除此以外，Ⅱ組植物根部的病變情況明顯比Ⅲ組嚴(yán)重，雖然都是接種豆類絲核菌，但菌株不同，病變程度也不盡相同（Ⅱ組為02-6B株，Ⅲ組為94-2B株），即表明02-6B菌株致病性比94－2B菌株致病性強(qiáng)，而由第三章中各菌株次級代謝產(chǎn)物中SW含量看，02-6B的SW含量同樣高于94-2B的含量，即表明菌株的致病性與其次級代謝產(chǎn)物中SW含量呈正相關(guān)。 3.3豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對動植物細(xì)胞損害的對比     從動植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)上來看，綠豆根部細(xì)胞病變同動物中毒后神經(jīng)細(xì)胞病變一樣，出現(xiàn)空泡變性，即SW細(xì)胞損害作用的特征病變，并結(jié)合SW含量與植物致病性的正相關(guān)作用在本次試驗中的體現(xiàn)，推測該次級代謝產(chǎn)物的植物致病作用仍與其中的SW有關(guān)。而植物細(xì)胞的細(xì)胞壁與內(nèi)膜的破裂則與動物中毒中所推測出的及文獻(xiàn)[15]報道的SW對動物細(xì)胞膜表面蛋白結(jié)構(gòu)的損害作用有一定的相似性，即推測在植物中，可能仍是由于SW的作用導(dǎo)致甘露糖苷酶Ⅱ受到抑制，從而使膜表面蛋白及細(xì)胞骨架合成障礙，從而破壞其結(jié)構(gòu)。而在植物中侵填體增加與動物細(xì)胞中糖元蓄積、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒等的作用結(jié)果均是營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)氖茏杷?。在植物中重要的能量產(chǎn)生單位――葉綠體，在次級代謝產(chǎn)物的作用下出現(xiàn)了固縮、顏色加深及葉綠體內(nèi)的空泡變性，這一病理變化是在沒有葉綠體的動物細(xì)胞中無法見到的。而在動物細(xì)胞中吞噬細(xì)胞溶酶體增多也是無法在沒有免疫吞噬細(xì)胞的植物中發(fā)現(xiàn)的。但有一點可以肯定，那就是該次級代謝產(chǎn)物對動植物細(xì)胞的總體作用均是阻斷了或抑制了細(xì)胞正常的物質(zhì)運輸及能量代謝。雖然動物的SW中毒已基本確定為其甘露糖苷酶的抑制作用所引起的細(xì)胞代謝紊亂[16]，而在植物的致病中目前對此仍無報道，但是從豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物作用后細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的病變與動物細(xì)胞病變有一定的相似性上看，SW仍在植物致病中發(fā)揮作用且和在動物中毒中發(fā)揮作用相同，即推測，SW很有可能不僅是動物豆類絲核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物絲核菌病中細(xì)胞損害的主要化學(xué)物質(zhì)。而要真正確定這一推論，并深入研究SW在動植物細(xì)胞中對代謝具體途徑的影響，以及該次級代謝產(chǎn)物中SW以外生物堿在動物中毒與植物致病中發(fā)揮的作用等一系列問題仍有待進(jìn)一步研究。