小檗堿對(duì)內(nèi)毒素致腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

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[url=]小檗堿對(duì)內(nèi)毒素致腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[/url] 段慧琴1 ，許劍琴1，張永東1，索占偉2，穆祥2*，喬建1* （1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094；2. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)科系，農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

[摘要] 目的：探討小檗堿對(duì)細(xì)菌脂多糖（LPS）致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIMEC)損傷的保護(hù)作用。方法：以原代培養(yǎng)的大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (RIMEC)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗堿預(yù)孵2h后加入1μg/ml 的LPS 刺激24h 檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清夜中一氧化氮（NO）的水平。NO測(cè)定采用硝酸酶還原法。結(jié)果：小檗堿在12h、24h時(shí)使活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO下降，與LPS比較差異極顯著（P<0.05），對(duì)內(nèi)毒素引起的NO升高有明顯下調(diào)作用。結(jié)論：降低NO分泌，保護(hù)LPS引起的血管內(nèi)皮損傷是小檗堿發(fā)揮其抗炎活性的機(jī)制之一。 [關(guān)鍵詞]：小檗堿；NO；LPS；微血管內(nèi)皮細(xì)胞 中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：   小檗堿屬異喹啉類生物堿，也稱黃連素，常用其鹽酸鹽，為毛莨科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖提取的主要成分，臨床上用于治療菌痢、腸炎、急性扁桃體炎和急性支氣管炎等多種疾患[ 1]。關(guān)于小檗堿的抗炎機(jī)制目前尚不清楚。為了闡明其的抗炎機(jī)制，本試驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察了小檗堿對(duì)腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響，以期進(jìn)一步揭示其臨床藥理作用。 1.材料和方法 1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清(購(gòu)自Gibco公司)、LPS ( E.coli O55:B5,購(gòu)自sigma公司)、NO試劑盒 ((購(gòu)自晶美生物工程有限公司)、小檗堿 (標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物鑒定所)。 1.2 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMEC）分離培養(yǎng)見以前所述【1】簡(jiǎn)述如下：選用出生24小時(shí)之內(nèi)SD大鼠乳鼠，用外科手術(shù)方法獲得空腸，Dhank’s液沖洗，縱向切開，沖洗，剪成小段，吹打數(shù)次。調(diào)整濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基用DMEM培養(yǎng)基，補(bǔ)充15％胎牛血清、100 U/ ml青霉素、10μg/ mL鏈霉素，置5%ＣＯ2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3ｄ換液1次。細(xì)胞達(dá)到80%融合生長(zhǎng)時(shí)即行傳代。倒置顯微鏡下,細(xì)胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列,無(wú)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象。免疫熒光法檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性。 1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞準(zhǔn)備及處理實(shí)驗(yàn)使用第5代細(xì)胞。將融合生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞以0.25％胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度5×107 cells/L，每孔500μl，置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合成單層細(xì)胞，開始實(shí)驗(yàn)。分組：（1）對(duì)照組（加含2％血清的維持培養(yǎng)基）；（2）LPS組（1μg/ml LPS）（3）小檗堿組＋LPS（分別用10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗堿預(yù)孵2h后加入1μg/ml 的LPS）（4）小檗堿組（10μg/ml 小檗堿），每組設(shè)復(fù)孔6個(gè)，分別于刺激后3、6、12、24h 收集上清液，貯存于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。 1.4 .細(xì)胞上清液內(nèi)NO含量測(cè)定采用硝酸還原酶法。以總硝酸鹽(NOX)含量表示NO濃度。測(cè)試方法參照試劑盒說(shuō)明書。 1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以ｘ±ｓ表示，組間差異顯著性判定采用ｔ檢驗(yàn)。 2.結(jié)果 2.1 小檗堿對(duì)RIMEC分泌NO的影響本試驗(yàn)利用還原酶法檢測(cè)了小檗堿對(duì)RIMECs 分泌NO的影響。結(jié)果顯示，10 μg/ml小檗堿在3h、6h內(nèi)可以促進(jìn)NO分泌，作用12h后對(duì)NO分泌影響減弱，24h時(shí)對(duì)正常NO分泌無(wú)影響，與正常組比較差異不顯著（見表1、圖1）。 2.2小檗堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的RIMEC NO分泌增高的影響如表1、 圖2所示，在3h、和6h時(shí)，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO 分泌升高均沒有影響；在12h和24h時(shí)，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗堿顯著降低NO分泌水平，可以下調(diào)LPS引起的NO的分泌升高，基本恢復(fù)至正常水平，與LPS組比較差異極顯著，但沒有劑量依賴性。 表1 不同濃度小檗堿在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)RIMECs分泌NO的影響 (ｎ=6,ｘ±ｓμmol/l) Table1.1: The effect of various concentrations ofBerberine on NO production in RIMECs (ｎ=6,ｘ±ｓ) Group 3h 6h 12h 24h Control 24.18±1.87 21.2±1.15 21.33±3.52 23.1±0.39 LPS (1 μg/ml) 27.20±0.58* 28.86±1.26* 46.75±0.56** 58.53±0.66** Berberine 1 μg/ml +LPS Berberine 5 μg/ml +LPS 30.34±0.79 26.81±1.06 26.55±2.69▲▲ 19.65±3.56 34.26±1.3 29.68±1.22 25.52±7.29▲▲ 19.5±0.26 Berberine 10 μg/ml +LPS 29.82±1.15 26.12±2.57 22.16±0.9▲▲ 21.89±0.52 Berberine 10 μg/ml 32.16±1.25** 30.90±2.28 25.46±2.46 24.11±1.01 *:（P<0.05） **:（P<0.01）：vs normal group,▲: P<0.05, ▲▲: P<0.01 vs LPS group 3.討論     內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液和組織之間的重要屏障，而且在許多病理生理過(guò)程（包括炎癥）中起著重要的作用【2】。越來(lái)越多的研究證明，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是內(nèi)毒素性休克、全身性炎癥反應(yīng)綜合癥以及多器官功能障礙的基本原因【3】。不同來(lái)源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上存在著一定的差異性[4]。腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)毒素作用的主要靶點(diǎn)之一，在大腸桿菌性腸炎及其引起的菌血癥和毒血癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。利用體外培養(yǎng)的腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以直接觀察藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用，從而在細(xì)胞水平對(duì)機(jī)理進(jìn)行深入研究。     NO在許多生理和病理生理狀態(tài)中具有遞質(zhì)、信使和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子的功能。研究認(rèn)為急慢性炎癥的發(fā)生均與NO有關(guān)系。在炎癥反應(yīng)中組織中誘生型NO合酶(iNOS)被誘導(dǎo)生成，產(chǎn)生大量NO，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，包括使血管舒張，形成水腫和局部紅斑，增加炎性滲出，細(xì)胞毒性作用以及細(xì)胞因子依賴過(guò)程的介導(dǎo)作用，促進(jìn)敗血癥的發(fā)展等。這也暗示了能夠抑制LPS引起的NO分泌增加的制劑對(duì)控制炎癥的發(fā)生發(fā)展具有潛在的的治療價(jià)值。     小檗堿具有在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。印度Dutta等在60年代發(fā)現(xiàn)小檗堿可以抑制幼兔的霍亂弧菌的傳染[5]。從那以后，印度科學(xué)家對(duì)該藥進(jìn)行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)了小檗堿可以抑制其他的細(xì)菌的傳染（包括霍亂弧菌），對(duì)原生動(dòng)物，真菌和利什曼原蟲均有抑制作用，并有報(bào)道發(fā)現(xiàn)用小檗堿治療霍亂[6]引起急性腹瀉。小檗堿對(duì)大腸桿菌耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素引起的幼兔腹瀉具有顯著療效[7]。但對(duì)其抗炎機(jī)理的研究報(bào)道較少。郝鈺等[8]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能下調(diào)IL-1、TNF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)。呂燕寧等[9]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿1.5mg/mL對(duì)二硝基氟苯(DN FB) 所致的小鼠DTH 有抑制作用, 其機(jī)制可能是抑制了IFN-C, IL-1, TN F-A, IL-2 等因子的產(chǎn)生和分泌, 從而抑制免疫反應(yīng), 減輕炎癥損傷。     本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌增加有明顯的抑制作用。小檗堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響反應(yīng)較慢，在12h和24h時(shí)作用較強(qiáng)，能夠抑制過(guò)多的NO分泌。在12h時(shí)，5、10 μg/ml的小檗堿可以抑制LPS引起的NO增加，24h時(shí)1、5、10 μg/ml的小檗堿均可以抑制LPS引起的NO增加，三個(gè)濃度組之間沒有明顯的劑量依賴性。結(jié)果提示小檗堿可以通過(guò)降低NO的分泌來(lái)發(fā)揮其抗炎活性，改善LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及循環(huán)障礙。     試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)靜息的腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能也有影響，3h、6h時(shí)使NO分泌升高，12h后又逐漸恢復(fù)正常。提示小檗堿在生理狀態(tài)下可能有舒張血管的效應(yīng)，而且存在自我調(diào)節(jié)機(jī)制，這也從一方面證實(shí)了血管內(nèi)皮釋放NO 是小檗堿產(chǎn)生血管松弛作用的內(nèi)皮依賴性機(jī)制[10]。     關(guān)于小檗堿在病理生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的的分子機(jī)制還需從小檗堿對(duì)eNOS和iNOS的活性及其mRNA表達(dá)的調(diào)控方面進(jìn)行深入研究。