甘肅棘豆抗腫瘤活性組分篩選試驗(yàn)*

貔貅

柳軍璽1，吳達(dá)1，2,師彥平1 ，王建華2 （1中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730000； 2西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

摘要:以甘肅棘豆(Oxytropis Kansuensis)提取物的乙酸乙酯部位、水相部位,以及生物堿和非生物堿部位，對(duì)荷S180和H22腫瘤小鼠進(jìn)行了體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，被試驗(yàn)的四個(gè)樣品中，非生物堿部位沒有抗腫瘤活性，乙酸乙酯部位和水相部位對(duì)S180和H22均具有一定的抑制作用，但作用都不及生物堿部位強(qiáng)；各試驗(yàn)組小鼠的胸腺、脾臟和體重均無明顯變化,這也表明四種組分樣品在試驗(yàn)用劑量時(shí)，對(duì)小鼠均無毒性反映。 關(guān)鍵詞:甘肅棘豆；S180；H22；抗腫瘤活性；活性篩選 The Screening of anti-tumor composition from Oxytropis kansuensis LIU Jun-Xi1, WU Da1,2, SHI Yan-Ping1Δ, WANG Jian-Hua2 (1Lanzhou Institue of Chemical Physics, CAS, Lanzhou 730000, China;2 College of AnimalScience and Veterinary Medicine, Northwest Sci.-Tech.University of Agriculture and Forestry, Shanxi Yangling 712100, China) AbstractScreening of the effective anti-tumor fractions from acetic ester fraction and water fraction as well as alkaloids fraction and non-alkaloids fraction of Oxytropis Kansuensis on mice bearing S180 and H22 in vivo. The results shown that the alkaloids fraction has obvious role on anti-tumor. To some extent, acetic ester fraction and water fraction also have effect on mice bearing S180 and H22 , but the effect of them are both inferior to that of alkaloid fraction. The weight analysis of immune organs and the gaining body-weight indicate that every treat has no toxic influence on mice and can not enhance the no-specific immune function of mice. Key wordsOxytropis Kansuensis；Sarcoma180；H22；anti-tumor effect；bioactive screening     甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis) 是西北牧區(qū)危害最嚴(yán)重的毒草之一，目前其研究熱點(diǎn)是防除和綜合利用［1］。 近年來研究表明,甘肅棘豆及其同屬植物總提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［2－4］，并認(rèn)為甘肅棘豆抗腫瘤作用的主要活性與其所含的生物堿苦馬豆素有關(guān)。然而，苦馬豆素在棘豆中含量很低，從棘豆中提取苦馬豆素的技術(shù)尚不成熟，為此研究甘肅棘豆植物抗腫瘤的活性部位顯得尤為重要。     選取甘肅棘豆乙酸乙酯部位和水相部位以及生物堿、非生物堿部位對(duì)荷S180和H22腫瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明試驗(yàn)選用的四個(gè)部位（乙酸乙酯極性部位、水相部位以及生物堿和非生物堿部位）中，生物堿部位抗腫瘤活性最強(qiáng)，非生物堿部位沒有抗腫瘤作用，其它兩個(gè)極性部位有一定的抗腫瘤活性，但作用都不及生物堿部位強(qiáng)。研究結(jié)果進(jìn)一步表明生物堿部位為甘肅棘豆抗腫瘤的主要活性部位。 1 材料與方法 1.1動(dòng)物及瘤株：     實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用昆明種小鼠，6～8周齡，體重20±2.0g，雌雄兼用，每批試驗(yàn)采用統(tǒng)一性別，由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-009號(hào)；實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度20～22℃，相對(duì)濕度45～50%，環(huán)境設(shè)施合格證：醫(yī)動(dòng)字第14-019號(hào)；S180肉瘤購于中國(guó)醫(yī)科院藥物研究所。按常規(guī)方法，無菌條件下，選擇生長(zhǎng)良好的S180肉瘤，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.46×106/ml，于小鼠右前腋下接種0.2ml/只。接種次日，隨機(jī)將接種好的小鼠分成3組，每組為10只。抑瘤試驗(yàn)重復(fù)三次。 1.2實(shí)驗(yàn)用藥物 A（乙酸乙酯萃取部位）、B（水相部位）、C（生物堿部位）和D（非生物堿部位），由中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，參照預(yù)試驗(yàn)及活性篩選給藥量，各樣品試驗(yàn)用劑量分別為：A：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；B：1.0 g/kg、3.0 g/kg；C：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；D：1.0 g/kg、3.0 g/kg。蒸餾水陰性對(duì)照組和各樣品試驗(yàn)組灌胃給予，接種24 h后開始給藥，給藥量0.2ml/10g體重；環(huán)磷酰胺（CTX）：中美合資山西泰盛制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：011121, 臨時(shí)用注射用水配成所需濃度（25mg/kg），腹腔注射給藥, 每日0.1ml/10g體重, 給藥10 d。 1.3實(shí)驗(yàn)方法     所有動(dòng)物每天給藥一次，連續(xù)10 d，并隔日稱體重一次，停藥次日脫頸處死小鼠，剖取瘤塊、胸腺及脾臟，并稱重，計(jì)算抑瘤率、胸腺系數(shù)、脾系數(shù)增長(zhǎng)率及體增重率。試驗(yàn)分批進(jìn)行，各樣品各劑量均進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。 腫瘤抑制率（%）=（1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）×100%； 胸腺（脾）重量系數(shù)（mg/10g）= 胸腺（脾）重量/去瘤重量×10； 胸腺（脾）重量系數(shù)增長(zhǎng)率（%）= [給藥組胸腺（脾）重量系數(shù)/對(duì)照組胸腺（脾） 重量系數(shù)]×100； 動(dòng)物增重= 去瘤體重- 起始體重； 動(dòng)物體重增長(zhǎng)率（%）= （給藥組增重- 對(duì)照組增重）/對(duì)照組增重×100。 固定好的瘤塊，切片后進(jìn)行病理檢查（HE染色）。所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2結(jié)果 2.1樣品對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的作用     A、B、C對(duì)小鼠移植性腫瘤S180均有明顯的抑制作用，重復(fù)性較好，且統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性（P<0.05-0.001）。A抑制率為35.85%～56.25%；B為39.84%～57.03%；C為34.38～64.06%。D對(duì)S180無明顯抑制作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性（P>0.05），抑制率為15.09～24.53%，見表1。 2.2樣品對(duì)小鼠移植性腫瘤H22的作用     A、B、C對(duì)小鼠移植性腫瘤H22均有一定的抑制作用，重復(fù)性較好，且統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性（P<0.05-0.001）。A抑制率為20.35%～48.67%；B為38.05%～41.43%；C為43.57～58.57%。D對(duì)H22無明顯抑制作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性（P>0.05），抑制率為20.35～24.78%，見表2。 2.3樣品對(duì)荷S180、、H22小鼠的免疫器官的影響     A、B、C對(duì)荷S180、H22小鼠的胸腺、脾臟重量系數(shù)與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異均無顯著性（P>0.05）。D1.0g/kg劑量時(shí)可提高荷S180小鼠的胸腺重量系數(shù)，增長(zhǎng)率為24.63%，與對(duì)照組相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性（P<0.05）。CTX胸腺、脾臟系數(shù)明顯降低（P<0.001）。 2.4樣品對(duì)荷S180、H22小鼠體重的影響     各樣品在不同劑量時(shí)對(duì)荷S180、H22雌雄小鼠的體重均有不同程度的影響。 2.5各組腫瘤切片病理檢查     蒸餾水陰性對(duì)照組小鼠腫瘤切片高倍鏡觀察: 腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)簇狀密集生長(zhǎng),排列緊實(shí),核較大濃染,形態(tài)各異,異型性明顯，生物堿給藥組和環(huán)磷酰胺組可見大面積紅染無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，腫瘤細(xì)胞明顯減少，殘存腫瘤細(xì)胞大多萎縮，核深染固縮或碎裂迫向死亡，也可見個(gè)別逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞，核明顯縮小，周圍胞漿紅染，核漿比例減小，呈規(guī)則的圓或橢圓型。組織間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；乙酸乙酯給藥組和水相部位給藥組腫瘤切片也可觀察到腫瘤細(xì)胞壞死。 3討論 3.1各樣品抑瘤作用分析     試驗(yàn)用四個(gè)樣品中，非生物堿部位各劑量組每次試驗(yàn)抑瘤率均小于30%，按抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選規(guī)程藥物療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確認(rèn)為沒有抗腫瘤活性；乙酸乙酯部位和水相部位對(duì)S180和H22均有一定抑制作用，但其抑制作用都不及生物堿部位強(qiáng)，這可能是由于抗癌活性生物堿在這兩個(gè)極性部位中不同程度分布的原因。因此，初步確定生物堿成分群是甘肅棘豆抗腫瘤的主要活性部位。 3.2各樣品對(duì)荷瘤小鼠免疫器官及體重的影響     本試驗(yàn)按照《免疫動(dòng)物篩選規(guī)程》中“免疫器官重量法”對(duì)荷瘤小鼠胸腺、脾臟進(jìn)行了重量分析，結(jié)果表明各樣品對(duì)荷瘤小鼠胸腺、脾臟沒有明顯的影響；和對(duì)照組相比，體增重率也無統(tǒng)計(jì)意義。說明各樣品試驗(yàn)用劑量對(duì)小鼠沒有毒性反映，也沒有提高荷瘤小鼠非特異性免疫功能。 3.3腫瘤病理切片觀察     腫瘤病理切片顯微鏡觀察可見，生物堿可使S180、H22惡性腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大面積壞死。這和已報(bào)道的研究結(jié)果相吻合，認(rèn)為棘豆屬植物生物堿可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。