幾種常見飼用酶制劑的酶活測定與分析

yuren925

幾種常見飼用酶制劑的酶活測定與分析
1．酸性蛋白酶的測定  2。纖維素酶的活力測定 3。植物酶活力測定 4。討論
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶制劑的生產(chǎn)成本日漸下降，越來越多的酶制劑被應(yīng)用在飼料工業(yè)中，它們在提高飼料的營養(yǎng)價值，減少糞便排放，改善生態(tài)環(huán)境和抵抗疾病等方面均發(fā)揮了積極作用。但由于酶活的測定比較繁瑣，酶活的定義、測定方法和測定條件不統(tǒng)一，可比性差，給廣大用戶在選購和使用時造成了諸多不便。而且在通常情況下飼用酶的作用效果往往需要經(jīng)過一段時間（至少15d）后才能得到顯示。許多不法分子利用這些因素，采用蒙騙手段銷售低劣飼用酶，用戶不經(jīng)測定而直接使用就難免會上當(dāng)受騙，造成經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)飼用酶制劑的生產(chǎn)廠很多，而真正高質(zhì)量的飼用酶并不多，使得許多用戶，尤其是養(yǎng)殖戶，對酶制劑的使用效果產(chǎn)生懷疑，從至拒絕使用。為了扶正驅(qū)邪，本文將針對幾種常用的飼用酶制劑進(jìn)行討論，簡要介紹它們的一些簡便的分析測定方法，供飼料生產(chǎn)廠和廣大養(yǎng)殖戶參考。 1.酸性蛋白酶活力的測定
1．1原理
福林試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），它使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)，利用這個原理可以測定蛋白酶活力的強(qiáng)弱。以酪蛋白為作用底物，在一定pH值和溫度下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時間后加入三氯乙酸，終止酶的反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開。經(jīng)過濾后取過濾液（含蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的三氯乙酸溶液），用Na2C03堿化，再加入福林試劑使之發(fā)色。藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱與過濾波中蛋白水解產(chǎn)物的量成正比例，而水解產(chǎn)物的量又同酶活力成正比。因此，根據(jù)藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱可以計算出蛋白酶的活力。
1．2操作方法

1．2．1 試劑
1．2．1．l福林試劑
于2000ml磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4•2H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO4•2H2O）25g。水700ml，85％的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10h，加入硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再蒸沸15min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色。若溶液有綠色，需再加數(shù)滴液溴，再蒸沸除去，冷卻后定容至1000ml，過濾，置于棕色瓶中保存，此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。
1．2．1．2 0.4mol／l的TCA溶液
稱取三氯乙酸65.4g，加水定容至1000ml。
1．2．1．3 0.8mol／l的碳酸鈉溶液
稱取無水碳酸鈉84.8g，加水溶解，定容至1000ml。
1．2．1．4 pH值為3.6的醋酸緩沖液
稱取NaAc•3H20 16g與268ml濃度為6mol／l的醋酸溶液混合，稀釋定容至1000ml。
1．2．1．5 2％酪蛋白溶液
稱取干酪索20g，加入0.lmol／l的氫氧化鈉20ml，在水浴中加熱溶解，然后用pH值為3.6的醋酸緩沖液定容至1000ml。該試劑配制后應(yīng)及時使用，或放入冰箱內(nèi)保存。
1．2．1．6 100μg／ml酪氨酸溶液
精確稱取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.lmol／l的鹽酸，使之溶解，加蒸餾水定容至1000ml。該試劑配制后也應(yīng)及時使用，或放入冰箱內(nèi)保存。
1．2．2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
配制濃度分別為（單位：μg／ml）：0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液，各取lml（做4個平行樣），加入不同的試管中，再各加入已稀釋的福林試劑lml和0.4mol／l的碳酸鈉5ml，搖勻，置于水浴鍋中，40℃保溫發(fā)色20min。然后在721型分光光度計上進(jìn)行比色測定（波長660nm，以濃度為0μg／ml的酪氨酸反應(yīng)液做空白對照）。

1．2．3 樣品酶活的測定
稱取酶粉5g，充分碾細(xì)，加蒸餾水1000ml，在 4O℃水中攪拌3Omin，充分溶出酶蛋白，然后過濾，濾液用0.1mol／lpH值為3.6的醋酸緩沖液稀釋到一定倍數(shù)。取稀釋液1ml（做平行樣4個），40℃水浴預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1ml，精確保溫10min。然后立即加入 0.4mol／l三氯醋酸2ml，終止反應(yīng)。繼續(xù)置水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀，然后離心分離或過濾。取濾液lml，再加入0.8mol／l碳酸鈉溶液5ml和已稀釋的福林試劑1ml，搖勻保溫發(fā)色20min后，進(jìn)行比色測定。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酪氨酸的釋放量。
l．2．4 酶活計算
蛋白酶活力＝A×4×N／10
式中：A——對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的酪氨酸釋放量；
4－－4ml反應(yīng)液取出1ml；
N－－酶粉的稀釋倍數(shù)；
10——反應(yīng)時間10min。
酸性蛋白酶酶活定義：在40℃，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位，

2 纖維素酶活力的測定

2．l 原理
纖維素酶是水解纖維素生產(chǎn)葡萄糖及纖維二糖的一類酶的總稱。包括C1酶、CX酶及纖維二糖酶。C1酶使天然纖維素晶體分鏈，成為直鏈纖維素。CX酶不能水解天然纖維素，但能分解直鏈纖維素β-1，4糖苷鍵生成纖維二糖。纖維二糖經(jīng)過纖維二糖酶作用生成葡萄糖。測定葡萄糖的方法很多，比較簡單的方法可以采用3，5-二硝基水楊酸法（簡稱DNS法）。3，5-H硝基水楊酸是一種氧化劑，能與還原糖作用，使硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬?。在一定的還原糖濃度范圍內(nèi)，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，據(jù)此可以推算出纖維素酶的活力。但是不同來源的纖維素酶對不同的天然纖維素的分解能力也不同，即使是同一種酶，對不同的天然纖維素的分解能力也不同。為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常以羧甲基纖維素鈉鹽（簡稱CMC）作為纖維素酶作用的底物。但需要指出的是CMC無論在結(jié)構(gòu)上還是在性質(zhì)上都不同于天然纖維素，天然纖維素不溶于水，而CMC有很強(qiáng)的親水性，非常容易被纖維素酶分解。在相同條件下，同一種纖維素酶分解CMC所產(chǎn)生的還原糖遠(yuǎn)大于水解天然纖維素所產(chǎn)生的還原糖。因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的數(shù)值總是比較高的，只能供作參考。
2．2 操作方法
2．2．1 試劑
2．2．1．l 二硝基水楊酸試劑
稱取酒石酸鉀鈉91g，溶于500ml水中，再依次加入3，5-二硝基水楊酸3．5g，NaOH2Og，加熱攪拌、溶解，再加入重蒸酚2.5g，無水亞硫酸鈉2.5g，加熱攪拌、溶解，冷卻后定容至 1000ml。儲棕色瓶中，放置一周后使用。
2．2．1．2 pH值為4.6的檸檬酸緩沖濃濃度為0.1mol／l的檸檬酸溶液26．7ml和濃度為0.2mol／l的磷酸氫二鈉溶液23．3ml，混合后加水稀釋到1000ml。
2．2．1．3 pH值為5.0的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液取濃度為0.2mol／l的磷酸氫二納溶液25．7ml和濃度為0.1mol／l檸檬酸溶液24.3m1，混合后加水稀釋至 1000ml。
2．2．1．4 羧甲基纖維素鈉鹽溶液稱取CMC 1g，加水1000ml，在水浴中加熱溶解，再加入20mlpH值為5.0的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液和 40ml水，混勻。
2．2．1．5 500μg／ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稱取分析純葡萄糖0.5g（在105℃干燥至恒重），加蒸餾水溶解，定容至 1O00ml。
2．2．2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度（單位：μg／ml）分別為：O、40、80、100、160、200、240的葡萄糖溶液。各取5ml加入到不同的試管中，再分別加入DNS試劑5ml，加熱煮沸5min，取出置冷水中冷卻，在721型分光光度計上比色。（波長為520nm，以濃度為0μg／ml的葡萄糖反應(yīng)液體作空白對照）。
2．2．3 樣品酶活的測定取纖維素酶粉5g，充分碾細(xì)，加100ml蒸餾水，與40℃水浴中，攪拌3Omin，使酶蛋白充分溶出，過濾，離心取上清液，稀釋至恰當(dāng)倍數(shù)。吸取稀釋的酶液lml，加入 CMC溶液4ml，混勻，在40℃保溫糖化30min，取出后加入NS試劑5ml，（空白樣：5ml蒸餾水十 5mlDNS試劑）蒸煮 5min，取出冷卻后進(jìn)行比色測定，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算葡萄糖的含量。
2．2．4 酶活計算CMC酶活＝（G × N）／（ V × t）式中：G――酶分解CMC釋放出的葡萄糖量，μg；N――酶粉的稀釋倍數(shù)；V一－反應(yīng)用酶量，g；t——反Jdl時間，min。纖維素酶活定義：在pH值為5.0，40℃條件下每分鐘水解 CMC釋放出1μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位。
3 植酸酶活力的測定

3．1原理
植酸酶能夠分解值酸，釋放出無機(jī)磷。選用植酸鈉為酶的作用底物，通過測定無機(jī)磷的釋放量可以計算酶活。目前植酸酶酶活的測定方法主要有4種，其中釩鉬磷法具有較高的權(quán)威性。該方法是Gist－Brocades和BASF公司在1991年提出的，其原理是利用植酸酶水解植酸鹽釋放無機(jī)磷，通過加入酸性鉬一釩試劑，使水解反應(yīng)停止，同時與水解釋放出來的無機(jī)磷產(chǎn)生顏色反應(yīng)，形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物，在415nm波長下測定磷的含量。以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（或標(biāo)準(zhǔn)植酸酶）為參照，計算酶活。該方法于1994年列入AOAC，我國已將此法的測定結(jié)果作為審批商品植酸酶注冊許可證和驗收產(chǎn)品的法定商檢依據(jù)。
3．2 操作方法
3．2．1 試劑
3．2．1．1 稀硝酸溶液量取100ml濃度為65％的濃硝酸，200ml蒸餾水混合。
3．2．1．2 鉬酸銨試劑稱取100g鉑酸鐵，溶解在800ml蒸餾水中，再加入10ml 25％的氨水，定容至 1000ml，儲介在暗處，保存期8周。
3．2．1．3 釩酸銨試劑稱取2.35g釩酸銨NH4VO3。，溶解在 400ml水中，預(yù)熱至55℃，加人20ml稀硝酸，定容至1000ml儲存在暗處，保存期8周。
3．2．1．4 釩鉬終止液取鉬酸銨溶液和釩酸銨溶液各50ml，混合，在加入100ml稀硝酸，混合，儲存在暗處，該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．1．5 醋酸緩沖液（pH值為5.5）稱取三水醋酸鈉30g和二水氯化鈣0.167g，溶解在約500ml蒸餾水中用冰醋酸調(diào)解pH值至5.5，定容至1000ml，保存期1周。
3．2．1．6 10％氯化鈣溶液稱取100gCaCl2。•2H20，加蒸餾水溶解，定容至1000ml，室溫儲藏。
3．2．l．7 植酸溶液（底物）。稱取1．4g植酸鈉，溶解在200ml醋酸緩沖液中，在常溫下用稀釋的冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5，定容至250ml（植酸鈉是無水的，Sigma公司生產(chǎn)，分子量為1104，最終植酸鈉的摩爾濃度為5.1mM），該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．1．8 磷酸儲備液稱取682mgKH2PO4（經(jīng)105℃烘干至恒重）溶解在100ml醋酸緩沖液中。0℃－ 5℃保存。
3．2．1．9 10mM標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液精確吸取10ml磷酸儲備液，用醋酸緩沖液稀釋至50ml，制成10mM磷酸溶液。該試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．2樣品酶活的測定稱取4g待測樣品，用小磨或研缽磨成細(xì)粉。加入50ml蒸餾水，再加 1.6ml10％氯化鈣溶液，攪拌溶解60min，使酶蛋白充分溶出。吸取10ml，用小型臺式離心5min轉(zhuǎn)速為3 000rpm），做4個平行樣。離心結(jié)束后各吸取1ml，分別加入到4支試管中（2支做酶活測定，另2支做空白）。同時再準(zhǔn)備4支試管，其中2支各加入1ml10mM的標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液，另 2支試管中各加入lml的醋酸緩沖液。酶樣液、標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液和緩沖液，均在t＝0時加入3ml植酸底物，37℃水溶，在t＝60min，各加人2ml反應(yīng)終止液，混合，測定各自的OD415?？瞻讟釉趖＝0時加入2ml反應(yīng)終止液，再加入3ml植酸底物，37℃恒溫水浴60min以后測定其OD415。
ΔOD415＝樣品OD415－空白OD415。
3．2．3 酶活計算
設(shè)：磷酸標(biāo)準(zhǔn)液ΔOD415為A，酶液ΔOD415為B。A＝標(biāo)準(zhǔn)磷酸液的OD415一醋酸緩沖液的OD415。B＝酶樣品OD415一酶空白液OD415。設(shè)：酶粉的重量為W，稀釋倍數(shù)為K，磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為P（單位：μmol／l）。酶粉中植酸酶的酶活（FYT／g）＝K×B×P/A×W×60植酸酶酶活定義：37℃，pH值為5．5條件下，每分鐘水解植酸鈉溶液釋放1微摩爾無機(jī)磷的酶量為l個酶活單位，簡稱為 1FYT。
3．2．4 注意事項
3．2．4．1 釩酸是有毒的。其小鼠試驗的半致死量LD50=18mg/kg.鉬釩終止液中釩酸的濃度為0．6mg/ml，最終的比色溶液中約含有釩酸0．24mg／ml。
3．2．4．2 OD415最大不應(yīng)超過0．8，若超過應(yīng)作適當(dāng)稀釋。
3．2．4．3上述測定方法適用于樣品中酶活＞50FYT／kg.
4 討論
    日前飼料行業(yè)對飼用酶制劑的生產(chǎn)還比較陌生，酶活的定義和測定方法至今還沒有統(tǒng)一.不同的生產(chǎn)廠家采用的標(biāo)準(zhǔn)和定義往往各不相同，許多產(chǎn)品說明也缺乏科學(xué)依據(jù)。事實上，飼用酶制劑的研究與應(yīng)用在國外也剛開始，許多研究工作還有待進(jìn)一步開發(fā)和深入。不同的日糧，需要不同的酶種。不同的動物、不同的生長期，飼用酶的添加量也不同.另外，飼用酶需要有較好的熱穩(wěn)定性，而這一點往往不為酶的生產(chǎn)者所重視。產(chǎn)酶菌種的選育關(guān)心的上要是酶的活力和產(chǎn)量。本文介紹的一些常用飼用酶制劑的測定方法也僅分析了在常溫下的酶活。有關(guān)酶的熱穩(wěn)定性，特別是在飼料高溫制粒過程中酶的活力損失需另行探討。

韓冰

好資料，并且是免費(fèi)的，頂。

米米拉撒

挺好的資料，不過有沒有植酸酶的這方面的資料啊

微塵

復(fù)合酶制劑的單酶要是有國標(biāo)，這個市場就不會太亂了