飼料中色氨酸含量的測定

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內(nèi)容介紹：原理：飼料中蛋白質(zhì)在酸性條件下水解成游離色氨 酸, 色氨酸吲哚環(huán)與對二甲胺基苯甲醛( PDA - B) 反應(yīng), 生成藍(lán)色化合物。加入亞硝酸鈉進(jìn)行重 氮化反應(yīng), 使藍(lán)色進(jìn)一步加深, 在一定范圍內(nèi), 顏 色深淺與色氨酸含量成正比。

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飼料中色氨酸測定方法 分光光度法

【標(biāo)準(zhǔn)名稱】 飼料中色氨酸測定方法 分光光度法

【標(biāo)準(zhǔn)號】 GB/T 15400-94

【標(biāo)準(zhǔn)文件】 飼料中色氨酸測定方法 分光光度法 （ 畜禽飼料與添加劑 ） 1 主題內(nèi)容與適用范圍 　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定飼料中色氨酸的原理和方法。 　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、混合飼料、濃縮飼料和單一飼料。 2 引用標(biāo)準(zhǔn) GB 6433 飼料粗脂肪測定方法 3 原理 　　飼料中蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，降解成多肽和游離的氨基酸，在酸性介質(zhì)中，氧化劑存在下，色氨酸吲哚環(huán)與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與色氨酸含量成正比。 4 試劑 　　除注明者外均為分析純。水為蒸餾水。 4.1 硫酸（GB 625）溶液、 c （1/2H 2 SO 4 ）＝21.2mol/L 　　量取 589mL硫酸徐徐加入約350mL水中，冷卻后用稀釋至1L。 4.2 1％對二甲氨基苯甲醛溶液： 1.0g對二甲氨基苯甲醛溶于21.2mol/L硫酸（4.1）中并定容100mL。 4.3 0.2％亞硝酸鈉（GB 633）溶液（ m / V ）。 4.4 10％氫氧化鉀（GB 2306）溶液（ m / V ）。 4.5 L-色氨酸，色譜純。 4.6 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 　　準(zhǔn)確稱取 25.0mgL-色氨酸于小燒杯中，加少量0.1mol/L氫氧化鉀溶液使之溶解，定量地轉(zhuǎn)移到250mL棕色容量瓶中，用水定容，濃度為100 μ g/mL。 注：本標(biāo)準(zhǔn)溶液 4℃冰箱中保存，一個月內(nèi)使用，濃度不變。 5 儀器、設(shè)備 5.1 分析天平：感量0.1mg。 5.2 分光光度計。 5.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速4000r/min。 5.4 實(shí)驗(yàn)室用粉碎機(jī)。 5.5 培養(yǎng)箱。 5.6 容量瓶：25mL、50mL、250mL。 5.7 10mL具塞試管。 5.8 刻度吸管：0.5mL、2mL、5mL、25mL。 6 試樣的制備 6.1 選取有代表性的試樣，按四分法縮分至200g，粉碎，全部通過0.25mm孔徑篩（60目）。 6.2 按GB 6433 脫脂并測定脂肪含量。脫脂樣品風(fēng)干后，混勻，裝入密封容器內(nèi)備用。 7 分析步驟 7.1 工作曲線的繪制 7.1.1 吸取色氨酸濃度為100 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.6）5.00、7.50、10.00、12.50、15.00、17.50mL分別置于25mL棕色容量瓶中用水定容，搖勻。溶液濃度分別為20、30、40、50、60、70 μ g/mL。 7.1.2 吸取各濃度溶液（7.1.1）1mL，分置具塞試管（5.7）中，空白管加1mL水向每支試管內(nèi)加入氫氧化鉀溶液（4.4）1mL，混勻，將試管放入冷水盆中，加5mL對二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），從冷水盆中取出試管，搖勻，在室溫（20～30℃，下同）放置30min。 7.1.3 向上述每支試管內(nèi)加0.2mL亞硝酸鈉溶液（4.3），搖勻，室溫放置25min。 7.1.4 以空白管調(diào)零，在590nm波長下，以1cm光徑測定各溶液吸光度值。 7.1.5 以色氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，或列出回歸方程式。 7.2 樣品測定 7.2.1 稱樣：按附表A建議的稱樣量稱取脫脂試樣兩份，精確至0.1mg。 7.2.2 水解：將試樣置于50mL容量瓶（5.6）中，在輕輕振搖中緩慢加入25mL氫氧化鉀溶液（4.4），使試樣濕潤且不粘壁，置于40±1℃培養(yǎng)箱（3.5）中水解16～18h。 7.2.3 離心：取出水解液冷卻至室溫后，用水定容，搖勻，取部分水解液以4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min。 7.2.4 顯色：取2mL上清液置具塞試管（5.7）中，并將試管放入冷水盆中，加入5mL對二甲氨基苯甲醛溶液（4.2），搖勻。每個試樣另取2mL上清液于具塞試管（5.7）中，加5mL硫酸溶液（4.1）作為樣品空白，搖勻，室溫放置30min。然后向每支試管內(nèi)加入0.2mL亞硝酸鈉溶液（4.3），搖勻，室溫放置25min。 7.2.5 比色：以樣品空白調(diào)零，在590nm波長處1cm光徑測定樣品溶液的吸光度值。 8 分析結(jié)果的表述 8.1 計算公式 式中： m ── 脫脂試樣質(zhì)量， mg； A ── 從工作曲線上查得色氨酸含量， μ g； F ── 脂肪分率。 8.2 結(jié)果的表示 　　兩個平行樣品的測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留二位小數(shù)。 　　試樣脂肪含量小于 4％時，式（1）和（2）所得結(jié)果在允許偏差之內(nèi)。 8.3 重復(fù)性 　　兩個平行樣品測定值的相對偏差，當(dāng)色氨酸含量小于 0.1％時，不大于4％；0.10％～0.50％時，不大于3％;大于0.50％時，不大于2％。 附　錄　 A 稱　　樣　　量 （參考件） 　　根據(jù)樣品蛋白質(zhì)、色氨酸含量確定稱樣量，經(jīng)試驗(yàn)研究建議不同飼料稱樣量如下： 蛋白質(zhì)含量，％ 飼 料 種 類 稱樣量， mg 10以下 　高粱、玉米 650～700 11～20 　小麥、大麥、糠麩、糠餅、配合料、混合料、各種葉粉等 450～500 21～30 　干酒糟、干粉渣、豆腐渣、雜豆、糟渣類 350～400 31～40 　棉仁餅、菜籽餅、蓖麻餅、向日葵餅、濃縮料 200～250 41～50 　蝦粉、豆餅、芝麻餅、酵母、豆粕、花生餅、國產(chǎn)魚粉 180～200 50以上 　魚粉、血粉、肉骨粉、蠶蛹、羽毛粉 160～180