中藥復方體外藥理研究思考

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劉成海

摘　要：回顧近年來國內外中藥復方體外實驗研究進展，結合個人工作體會，對中藥復方體外藥理研究方法、存在問題與發(fā)展展望初步綜述與思考。提出要加強中藥復方研究體外研究，需提高受試藥物質量控制；一分為二看待藥物直接或含藥血清間接添加的試驗方法，兩者宜共同發(fā)展相互補充；注意細胞模型的合適性，宜藥物的細胞毒理與藥理相結合、先進與基礎指標相結合，謹慎推理結論；充分發(fā)揮體外實驗快速、敏感、特異、易控等特點，復方整體與單味成分、化學物質與藥效功能結合研究，以闡明復方的藥理機制與物質基礎，提高復方藥理研究水平。
關鍵詞：@中藥復方/藥理學；體外
分類號：R285.5　　　文獻標識碼：A
文章編號：1003-9783(2000)01-0053-04▲

　　體外藥理研究具有快捷迅速、敏感特異、條件易控等優(yōu)點，在藥物的活性篩選、毒性評價與深入的細胞分子藥理等研究中起重要作用［1］。隨著細胞生物學與生化學技術的不斷發(fā)展，體外藥理研究方法日新月異，使得人們能夠更加快速、準確、深刻地認識藥物的毒理與藥理。復方研究借鑒現(xiàn)代藥理方法，體外試驗日益增多，取得了許多進展，如日本小柴胡湯防治肝病的系列藥理研究。但是由于中藥成分復雜，我國復方體外藥理研究基礎較薄弱，需要在實踐中不斷發(fā)展提高。

1　日本近期小柴胡湯體外藥理研究的特點

　　慢性肝炎目前尚缺乏特效藥物，日本的慢性肝炎尤其是丙型肝炎發(fā)病較高，在臨床治療中廣泛采用小柴胡湯，療效顯著，一些學者就其抗肝損傷與抗肝纖維化的作用機理進行了系統(tǒng)研究，近 10 年來，Medline 收錄相關論文 136 篇，部分發(fā)表于核心刊物如 Hepatology［2，3］，引起國際肝病學界的關注［4］。
　　這些研究大都采用了體外試驗，有以下幾個特點：a.測定復方中每單味生藥的主要成分含量，全方質控明確；b.全方或單味藥經提取制備為藥物粉末，測定其主要成分含量，并分離可能的數(shù)種主要藥效成分；將全方與單味藥的粗提物、單體成分直接溫育培養(yǎng)細胞，進行全方的量效觀察，以及全方、單味藥與單體成分的藥效比較；c.緊扣疾病病理，闡明主要藥理機制。如肝纖維化病理關鍵在于過氧化等引起的肝星狀細胞活化。圍繞該病理，發(fā)現(xiàn)小柴胡湯重要作用機制之一在于抗氧化；d.通過對主要藥效指標的比較觀察，發(fā)現(xiàn)該方的主要活性成分是黃芩甙與黃芩甙元，這些物質與既往所發(fā)現(xiàn)的抗肝纖維化成分-水飛薊素、槲皮素有相似結構，均為黃酮類，提示有可能由此發(fā)現(xiàn)一類抗肝纖維化新藥。

2　加強成分分析與制備工藝，提高受試藥物質量控制

　　受試藥物質量的穩(wěn)定是藥效穩(wěn)定的前提與基礎。體外試驗反應靈敏，如果復方成分含量變化過大，則藥效重復性差，難以準確地反映其藥理機制，也無法闡明其物質基礎。受試藥物的質控包括藥材與制備工藝兩個方面。藥材的質控內容較多，包括種屬、產地、藥用部位、采收加工與鑒定檢查等，其中成分含量測定是核心。雖然中藥成分繁多，含量低微，檢測困難，但是這些化學物質成分是決定藥效的重要物質基礎，體外試驗用量少，敏感性強，成分含量的相對穩(wěn)定對于體外藥效實驗重復穩(wěn)定性具有重大意義。盡管難以弄清楚每一種成分，但應盡可能對復方中各藥物的主要成分建立檢測質控標準。且制備工藝必須穩(wěn)定，盡量“純化”復方粗提物，減少雜質等的影響。

3　添加方法選擇與血清藥理學界定

　　對于復方中藥，是粗提物直接添加還是制成含藥血清間接添加，已有報道［5，6］。80 年代曾見小柴胡湯等方藥的血清藥理研究，可是近來聲音漸微，但 90 年代傳入我國后卻在國內興盛起來，對方法學以及采用該方法進行藥理學研究的報道日漸增多［7］。有的學者對此寄予厚望，認為不僅可進行藥效學研究，也可進行復方血清藥化學與藥動學研究，血清藥理學將成為一門新型分支學科。
　　歸納起來，大致認為直接添加有三方面缺點：a.缺乏復方的體內代謝物或機體反應物等實際有效成分，引起假陰性；b.機體非吸收物質的體外作用，造成假陽性；c.粗提物理化性質如雜質、酸堿度、滲透壓、pH 值等對離體系的干擾。而含藥血清法具有兩大優(yōu)勢：a.體現(xiàn)復方藥物的體內生化轉化效應；b.克服藥物本身理化性質對實驗的直接干擾。
　　雖然應用血清藥理學方法在復方藥理研究中取得了一些積極進展，但是，該方法究竟是不是中藥復方最佳的體外試驗方法，發(fā)展前景如何?這些問題尚需進一步討論與實踐發(fā)展的檢驗。雖然直接添加法存在諸多缺點，但可以較好地控制受試藥物主要成分質量，較穩(wěn)定地進行藥物量效觀察，較方便地進行體外毒理藥理研究，易于重復。臨床上中藥多為水煎口服，水溶性物質多為主要有效成分［8］，因此離體系統(tǒng)中溶于水的粗提物也是可以反應復方藥效的，而一些理化干擾因素是可以避免的，如雜質的去除、酸堿度與滲透壓的調整等，而且隨超細粉末等新技術的發(fā)展應用，粗提物質量可進一步提高，干擾進一步減少。而藥物血清材料可來自各種不同生理病理狀態(tài)的個體，會出現(xiàn)含藥血清差異；而且經過體內反應，藥物含量進一步被稀釋，成分更加復雜，增加了質控難度。血清中部分物質已是藥物作用機體細胞的反應，如果細胞存在反饋機制，血清二次重復作用于細胞，將可能掩蓋藥物血清的實際作用。含藥血清對離體系統(tǒng)同樣也有干擾，如血清本身對體外酶活性的影響等。關于藥物血清添加法與粗提物直接添加的優(yōu)劣比較及與整體藥效學的相關性，目前尚無嚴格統(tǒng)計學意義上的研究。藥物血清學技術標準化與規(guī)范化也尚未建立，目前還難以確證兩種方法孰優(yōu)孰劣，含藥血清與在體實驗是否有相關一致。
　　我們及其他一些單位采用兩種添加方法進行試驗［9，10］，其結果有相似性。理論上固然可以從有效含藥血清中分離成分，研究復方物質基礎，但血清中中藥成分含量低微，加上血清本身干擾，分析難度加大。通過復方成分逐步有機分解結合藥物篩選，也同樣可以較好闡明其物質基礎。無論何種添加，都只是一種方法，目的在于明確藥物的作用機制。血清藥理學有長處，目前研究較熱，但有局限性，作為一種尚不成熟的實驗方法，還需要發(fā)展完善［11，12］；直接添加法同樣也能反映藥效，通過不斷改進提取純化技術，可逐步克服自身缺點，對其似乎不宜過早下否定的結論。對兩種方法應實事求是辯證看待，相互補充，共同發(fā)展。

4　合理選擇受試對象與檢測指標，謹慎解釋實驗結果

　　與體內試驗相比，體外試驗有其特殊性。對受試對象多為培養(yǎng)細胞的離體系而言，以下幾個方面值得注意。
4.1　細胞模型　首先要考慮針對性與簡便性。藥理研究當然要選擇與疾病發(fā)生密切相關的細胞，如抗腫瘤藥物選用腫瘤細胞。但藥物是否對所選細胞相對特異有效?可增加試驗細胞種類，進行比較。細胞類型甚多，實驗難易程度相差很大。對預初試驗與復雜條件的摸索，可用性質相近來源方便的細胞株代替。例如用成纖維細胞株代替肝星狀細胞，觀察抗肝纖維化含藥血清的諸多因素影響，建立某些指標檢測方法等。其次要考慮受試細胞的病理生理狀態(tài)，有的細胞在體外基本是正常生長，不具備病理意義，藥物的作用可能是細胞毒性。而藥理研究在于觀察藥物對病理過程的干預，因此需要造模，在細胞分離前體內或分離后體外予以一定因素誘導。如欲觀察藥物對肝細胞損傷的影響，可加四氯化碳或乙醇刺激等。另外要考慮細胞體外生長規(guī)律，以確定最佳用藥時間與細胞密度。培養(yǎng)細胞往往有密度抑制的特性，一般藥物作用于指數(shù)分裂期或前期可較好地反映藥效［13］，而控制細胞密度可滿足不同實驗要求［14］。如細胞 60%～75% 融合，可觀察急性毒性，而降低密度并延長藥物作用時間，可觀察慢性毒性影響。
4.2　細胞毒性　化學成分通過細胞毒性試驗，估算 ID50等數(shù)值，對評價藥物毒性，指導實驗或臨床用量等有十分重要意義。復方中藥細胞毒性怎樣?以含藥血清方式添加會發(fā)生什么改變?怎樣借鑒化學成分細胞毒性研究方法評價復方毒性?尚需探討。細胞終點毒性指標較多，如乳酸脫氫酶活性、［3H］亮氨酸摻入、線粒體 MTT 轉化等，測定均較簡便易行。雖然復方中藥及其含藥血清復雜，未知因素較多，開始較難做到準確的 ID50 等測定，但結合形態(tài)觀察與生化檢測對于大致觀察細胞毒性及更好了解藥理是有益的。
4.3　指標選擇與結果解釋　盡量采用新方法與新技術，從細胞分子乃至基因調控等水平闡明中藥的作用機理，是體外實驗的優(yōu)勢與目的。但是中藥的復雜性可影響敏感的體外藥效的穩(wěn)定性，對基礎關鍵性指標應從多個方法學角度觀察并重復驗證，增強可信性。一種細胞學生物功能常有多個反映指標，例如，對于細胞膠原蛋白生成量，通過細胞化學染色與圖像分析可直觀半定量觀察原位沉積，ELISA 法可定量分析Ⅰ型等膠原的含量，而通過同位素標記摻入與膠原酶消化可測定其膠原生成率，這樣綜合不同角度的指標可得出較可信的結論。而一項指標可反映細胞多種功能變化，例如現(xiàn)在多用 MTT 法所反映的活細胞數(shù)量來判斷藥物的增殖影響，但這種細胞數(shù)量受多種因素影響。如細胞數(shù)量減少不僅反映增殖抑制，也可能是凋亡或毒性死亡增強。需增加觀察指標，如［3H］TdR 摻入所反映的 DNA 合成，可解決問題。此外體外實驗敏感性強，與體內實驗有差異［1］。而中藥成分復雜，影響因素多；受試細胞不同病理生理狀態(tài)也有不同影響，因此結論宜慎重，需全面考慮，歸納多方資料而作出。

5　整體復方與部分成分、物質基礎與藥理機制相結合研究

　　復雜的中藥復方理論上可以從不同層次分解為每一清楚的組成部分，即單味藥及其化學成分，但復方卻不是這些組成部分的機械組合，而是一個復雜的有機體系。研究發(fā)現(xiàn)［15，16］，全方在成分與藥效上都不等于單味藥的機械總和。從辯證角度看，作為全方的“整體”與構成這個整體的“部分”—單味藥及其成分是復方中對立統(tǒng)一的兩個方面，符合“系統(tǒng)與要素”的范疇。要素(單味藥及其成分)之間相互聯(lián)系與作用，形成配伍關系，構成系統(tǒng)整體(全方)，產生系統(tǒng)質。這種系統(tǒng)質表現(xiàn)為“結構與性能”兩個方面，諸要素有機組成為系統(tǒng)全方的內部結構(物質基礎)，并決定其外在性能(藥效)表現(xiàn)。因而研究復方可從“系統(tǒng)與要素”、“結構與性能”兩對范疇中去把握。對于藥效作用，不能局限于整體復方，應深入分析各種要素的作用及其相互關系；也不能僅局限于復方的外部性能認識，可結合組成成分的藥效與成分分析，認識決定這些藥效性能的內在物質基礎，這樣才能深刻全面地把握復方藥物的作用機制。
　　方法上，可以有目的地分離部分主要化學成分，與全方比較主要藥效作用，從而發(fā)現(xiàn)主要藥效成分，如上所舉的小柴胡湯的研究工作。這種方法目的選擇性較強，工作量相對較小，容易操作；但是忽視了方藥合煎的作用，成分的主觀選擇容易造成遺漏，而且忽視了成分之間的相互作用。另一方法，是以主要藥效指標為指引，先復方正交實驗，了解主要藥效藥物及其配伍關系；而后對復方進行逐步植化分離，對每一步分離物都進行藥效觀察，追蹤活性部位，逐層深入，可望闡明復方的物質基礎與作用機理［17］。這些工作均涉及藥效觀察，藥理模型是其關鍵，如果采用整體動物模型，工作量將十分龐大。因而需要建立合適的體外模型，充分發(fā)揮體外試驗周期短、用量少的特點，進行大量的藥物活性試驗。
　　中藥復方是中醫(yī)辨證論治理論精髓的具體體現(xiàn)，復方研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重點與難點之一。我國近年來復方體外藥理研究取得了許多進展，但與化學藥物和國外某些復方藥理研究相比有較大差距。需要我們進一步解放思想，實事求是，既要敢于突破傳統(tǒng)方法，也不可照搬他人辦法，需根據(jù)中醫(yī)藥的實際，圍繞“作用機理與物質基礎”之目標，藥理與植化相結合，在充分開展臨床與體內藥理研究的同時，也大力加強復方體外實驗研究，以提高復方研究水平。

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