高免血清及卵黃抗體的制備技術(shù)

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免疫血清
　　1.動物的選擇
可作為免疫用的動物多為哺乳類和禽類，主要有家兔、綿羊、馬、豬、驢、豚鼠和雞等，其中實驗常用家兔、綿羊、雞和豚鼠。選擇動物時要注意以下幾個方面：
　　a.抗原與動物種系
動物性抗原的免疫原性，隨動物種系遠近而有差別。近緣動物的蛋白質(zhì)免疫原性弱，反之則強。因此選擇動物時應(yīng)選用親緣關(guān)系較遠的動物。
　　b.免疫血清的用量
所需要的免疫血清，如是經(jīng)常大量地使用，選擇免疫動物時則應(yīng)選擇大動物；如所需的免疫血清量不大，則以選擇小動物為宜。
　　c.動物的個體狀態(tài)
用于免疫的動物必須是適齡、健壯、無感染的動物。免疫過程中應(yīng)特別注意營養(yǎng)和衛(wèi)生管理。注射抗原1個月后，動物仍無良好的抗體反應(yīng)，或在規(guī)定注射日程后抗體效價不高，可再注射l～2次，若仍不佳者立即棄去．
　　2.抗原制備與接種
制造抗血清，根據(jù)產(chǎn)品不同,所用抗原、制法亦有所不同。病毒性抗血清，一般是用本動物的含毒組織作抗原，首先把強毒接種本動物，使其發(fā)病，采取其含毒性組織作為抗原，注射于免疫動物。細菌性血清，是用抗原性好的強毒或弱毒菌種，接種于規(guī)定培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃培養(yǎng)，細菌發(fā)育良好者，以純粹檢驗后用作抗原。

抗原接種：動物在免疫過程中分為基礎(chǔ)免疫及高度免疫?；A(chǔ)免疫一般是注射疫苗，然后連續(xù)多次注射強毒進行高度免疫，每次注射劑量，要隨著注射次數(shù)的增加而增加。接種抗原的次數(shù)和劑量，應(yīng)根據(jù)制造抗血清的品種和動物健康情況加以調(diào)整。為了獲得效價高的抗血清，動物飼養(yǎng)條件必須保持良好。
　　3.血清抗體的檢測
免疫程序接近結(jié)束時，測定血清的抗體效價，如果效價已達規(guī)定的要求，即可視作免疫成功，開始采血。若經(jīng)試血，血清效價不合格，則可繼續(xù)增加注射抗原次數(shù)或劑量，如再試血仍不合格，應(yīng)將動物淘汰。

測定免疫血清效價是及時掌握采血時機的重要步驟。常用的有環(huán)狀沉淀反應(yīng)(包括抗原稀釋法和抗體稀釋法)和雙向瓊脂擴散試驗。

用瓊脂擴散試驗測定血清效價時，如果在抗原孔與抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線者，即為陽性。最高稀釋倍數(shù)血清孔出現(xiàn)沉淀線，即為該血清的抗體效價。瓊脂擴散試驗的效價通常比環(huán)狀沉淀反應(yīng)稍低。
　　4.血清采集與提取
免疫后，經(jīng)試血，抗體滴度達到要求后可采血。動物采血應(yīng)在上午空腹時進行，禁食一夜，可避免血中出現(xiàn)乳糜而獲得澄清的血清。不論免疫動物是大動物或小動物，采血方法均分一次放血和多次放血法兩種。

　　a.一次放血
綿羊或其他大動物可用頸動脈放血，家兔、豚鼠和雞則可通過心臟直接采血。

　　b.多次少量放血法
大動物可通過靜脈采血，家兔、豚鼠和雞等小動物可通過心臟采血。


免疫血清的分離應(yīng)在無菌條件下進行，并應(yīng)盡量防止溶血。采血用的器械、容器等用前要進行滅菌，以無菌操作采血，注入斜放的大試管或三角瓶內(nèi)，待凝固后分離血清，將多份分離出的血清混合，待檢。
　　5.免疫血清的檢驗
免疫血清的檢驗包括無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。無菌檢驗按成品檢驗的有關(guān)規(guī)定進行；安全檢驗通常用體重18～22g的健康小白鼠5只，各皮下注射血清0.5ml，用體重250～450g的健康豚鼠2只，各皮下注射血清10ml，觀察10天，均應(yīng)健活，效力檢驗則按各種抗血清規(guī)定方法進行。
卵黃抗體
　　免疫血清和卵黃抗體是緊急預(yù)防和早期治療相應(yīng)傳染病的有效制劑。為了降低成本，增加產(chǎn)量，提高治療效果，對健康母雞進行法氏囊病高度免疫，取其卵黃來防治法氏囊病,不但省去殺雞分離血清的麻煩，而且具有產(chǎn)量高、效果好、價格便宜等優(yōu)點。現(xiàn)以法氏囊病為例，簡要闡明高免卵黃抗體的制備。
1.制造用雞的選擇
選擇健康的蛋雞，隔離飼養(yǎng)觀察l周后無特殊反應(yīng)者，方可免疫。
　　2.疫苗免疫
通常使用組織滅活苗，其制備過程如下：
　　a.制備雞的選擇　選40～50日齡SPF雞，用通過SPF雞傳代的野毒滴鼻、點眼，每只雞接種0.2～0.3ml，在48～72h左右死亡的雞，無菌采集其法氏囊，并作病變觀察，將病變典型的法氏囊低溫保存?zhèn)溆谩?/font>
　　b.制苗　取10g病料加100ml0.5％甲醛生理鹽水，勻漿、凍融、過濾，濾液加8％甘油，置37℃18～24h滅活，即為水劑滅活苗，也可加白油等佐劑，制成油乳劑滅活苗。
　　c.無菌檢驗　取滅活苗0．5ml接種于普通瓊脂斜面及厭氧肉湯培養(yǎng)基各一支，于37℃培養(yǎng)48h，應(yīng)無菌生長。
　　d.安全試驗及保護試驗　經(jīng)無菌檢驗合格的滅活苗，給40～50日齡SPF雞或未經(jīng)法氏囊疫苗免疫過的健康雞，肌肉注射、滴鼻、點眼、接種0.3～0.5ml，觀察半月，無法氏囊病發(fā)生者，可用1：10強毒0.5ml／只攻毒，觀察l0～14天，無發(fā)病者為安全有效。
　　免疫程序　第一次免疫，每只雞肌肉注射lml，經(jīng)7～10天后進行第二次免疫，每只雞2ml，7天后用瓊脂擴散方法測定卵黃抗體效價，如已達到1：64以上，即可收集高免蛋，如效價不高，可隔7～l0天進行第三次加強免疫。
　　3.高免卵黃抗體的制備
　　a.高免蛋的處理　高免蛋用0.1％新潔爾滅溶液浸泡5min，洗滌干凈，放入無菌室晾干備用。

　　b.分離卵黃　無菌操作，打破蛋殼，分離蛋黃。

　　c.卵黃勻漿　收集的蛋黃置無菌的組織勻漿器中，加等量滅菌生理鹽水，并按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1000單位，硫柳汞1.0／萬，勻漿、過濾,分裝消毒瓶內(nèi)，4℃冷藏備用。

　　4.高免卵黃抗體的檢驗

　　a.無菌檢驗　取0.5ml高免卵黃抗體，分別接種于普通瓊脂斜面和厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時，應(yīng)無細菌生長。

　　b.安全檢驗　取30日齡健康雞10只，每只雞肌注卵黃抗體2ml，觀察5～7天，應(yīng)無任何不良反應(yīng)。
　　c.中和試驗　取30日齡健康雞20只，隨機分成2組。試驗組每只雞皮下或肌肉注射野毒和卵黃抗體（1：10)混合液1ml，觀察飼養(yǎng)10～15天，應(yīng)全部存活，對照組每只雞皮下或肌肉注射野毒1ml，觀察10～15天，應(yīng)部分或全部死亡，剖檢后出現(xiàn)典型病變。

　　d.卵黃抗體效價測定　用瓊脂擴散反應(yīng)測定，抗體效價應(yīng)在1：64以上。

yangtao588688 于 2009-2-11 16:22 補充以下內(nèi)容

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