抗菌肽的作用機(jī)理及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

秋深葉一

　抗菌肽（anti－microbial peptides）是生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有抗菌作用的生物活性肽，在機(jī)體抵抗病原入侵方面起著重要作用。
1 抗菌肽的類型及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

根據(jù)抗菌肽的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特征可分為4類，即天蠶素（cecropins）。防御素（defensins）、蛙皮素（magainins，富含脯氨酸的抗菌肽）和蜂毒素（melittins，富含甘氨酸的抗菌肽）。
　　1.1 天蠶素（cecropins）目前報(bào)道的天蠶素約有30種。這類抗菌肽的結(jié)構(gòu)已比較明確，由31～39個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約4kD左右，含較少的半胱氨酸（Cys，不能形成分子內(nèi)的二硫鍵，有強(qiáng)堿性的N端和強(qiáng)疏水性的C端，C末端酰胺化。在肽的許多特定位置有較保守的殘基，如2位上的色氨酸，5、8和 9位有1個(gè)或 2個(gè)賴氨酸（Lys），11位是天冬氨酸（ Asp）， 12位是精氨酸（ Arg）。有些位置盡管殘基不同，但仍為保守替換。對(duì)抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的理論預(yù)測(cè)及CD譜和二維核磁共振數(shù)據(jù)表明，其分子結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)α-螺旋： 5～21位為第一個(gè)螺旋，該螺旋中極性與非極性氨基酸含量相當(dāng)，因而對(duì)水和脂均具親和性，即為兩親性α-螺旋； 25～37位為第二個(gè) α-螺旋，其疏水氨基酸含量高，故該α-螺旋疏水性強(qiáng)。兩個(gè)α-螺旋間由22－24位的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸（Ala－Gly－Pro）組成的鉸鏈區(qū)（也稱結(jié)節(jié)部）連接?？咕牡穆菪?卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)保持高抗菌活性具有特殊的重要性，而酰胺化的C端則對(duì)其廣譜作用極為重要。
　　1.2 防御素（defensins） 防御素是美國(guó)Ieherer實(shí)驗(yàn)室首次從兔肺巨噬細(xì)胞中分離得到的兩個(gè)陽(yáng)離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽，命名為defensin?，F(xiàn)已在不同種屬動(dòng)物的吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20多種。大多數(shù)防御素由38～43個(gè)氨基酸殘基組成，帶有一個(gè)凈正電荷，含有6個(gè)位置保守的半胱氨酸并構(gòu)成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，二硫鍵與抗菌活性密切相關(guān)。defensin由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：1個(gè)柔韌的 N瑞環(huán)、中部的雙親α-螺旋中心和帶有擬β-轉(zhuǎn)角的反向平行的β-片層的C末端。α-螺旋和N端環(huán)通過(guò)二硫鍵分別與β-片層的兩條鏈穩(wěn)定相連，一種  Cys－ Xaa－ Xaa－ Xaa－ Cys或  Cys－ Xaa－Cys結(jié)構(gòu)在不同種類防御素的分子結(jié)構(gòu)中普遍存在，使α-螺旋得以穩(wěn)定。
　　1.3 蛙皮素（magainins）蛙皮素最初是Zasloff等在非洲爪贈(zèng)皮膚和胃粘膜腺體上皮細(xì)胞中分離到的小分子抗菌肽。這類肽帶正電荷，根據(jù)其殘基數(shù)目又可分為兩類：一類是小分子肽類，由15～43個(gè)氨基酸殘基組成，都含有Arg一Pro或Lys－Pro氨基酸對(duì)，有些則是典型的Arg－Pro－Arg結(jié)構(gòu)；另一類是分子量較大的肽，由83個(gè)氨基酸殘基組成。其分子可分為兩個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，N端富含脯氨酸的P結(jié)構(gòu)域和由其余富含甘氨酸的肽構(gòu)成的G結(jié)構(gòu)域。
　　1.4 蜂毒素（melittins）這類抗菌肽的共同特點(diǎn)是富含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸，有些則是某一結(jié)構(gòu)域富含甘氨酸。不含或含很少的半胱氨酸，不能形成分子內(nèi)二硫鍵，氨基酸殘基上不具修飾基團(tuán)。分子量為8～27個(gè)kD。通常這類抗菌肽均在N端有一個(gè)富含脯氨酸的P結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)富含甘氨酸的G結(jié)構(gòu)域。P和G兩種結(jié)構(gòu)域的存在可能與其廣譜抗菌作用有關(guān)。由于其具有較強(qiáng)的溶血作用而限制了其作為抗菌物質(zhì)的使用。
2  抗菌胱的作用機(jī)理
　盡管關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)理已研究得較多，但目前仍未十分明了?，F(xiàn)行的抗菌肽作用模型認(rèn)為，抗菌肽通過(guò)在細(xì)胞膜上形成離子通道造成內(nèi)容物大量外泄而致細(xì)胞死亡。Christeson等認(rèn)為，抗菌肽首先通過(guò)靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入細(xì)胞膜中的疏水區(qū)域，通過(guò)改變膜構(gòu)象，多個(gè)抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄露致細(xì)胞死亡。Fink等認(rèn)為只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的雙親螺旋只結(jié)合在膜表面。Juvvadi（1997）推測(cè)抗菌作用的第1步是抗菌肽的陽(yáng)離子與膜上磷脂基團(tuán)的陰離子之間相互作用，再與膜上碳?xì)浠衔锘プ?，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。Park（1997）發(fā)現(xiàn)蛙的1種抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌機(jī)理，它不裂解細(xì)胞膜，而是穿過(guò)膜后與DNA、RNA結(jié)合，快速導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽可通過(guò)抑制細(xì)胞呼吸、抑制細(xì)胞外膜蛋白的合成或抑制細(xì)胞壁的形成等機(jī)制來(lái)殺死細(xì)菌。目前對(duì)抗菌肽抗真菌的機(jī)理研究較少，Cavallarin（1998）發(fā)現(xiàn)位于Cecropins衍生物N末端螺旋區(qū)域的11個(gè)氨基酸順序與抗真菌活力有關(guān)；Lee等（1989）則觀察到真菌受抗菌肽作用后，細(xì)胞膜上有空洞形成，推測(cè)其與抑殺細(xì)菌的機(jī)理類同。

研究表明抗菌肽并不作用于高等動(dòng)物細(xì)胞，這可能是由于高等動(dòng)物細(xì)胞膜中的膽固醇阻礙抗菌肽的疏水面插入磷脂雙分子層；也可能是由于微生物與高等動(dòng)物細(xì)胞膜的膜外結(jié)構(gòu)的區(qū)別：高等動(dòng)物細(xì)胞膜外表面的唾液酸與膜的距離有8nm，它可能與抗菌肽的帶正電區(qū)結(jié)合而阻止其接近細(xì)胞膜發(fā)揮殺傷作用。
3　動(dòng)物體內(nèi)的抗菌研究
　　各種動(dòng)物在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過(guò)程中，其體內(nèi)已建立了一套維持其體內(nèi)菌群穩(wěn)態(tài)的機(jī)制?？咕氖沁@一機(jī)制中的主要因子之一，廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物機(jī)體中。例如，豬抗菌肽（PR－39）已被發(fā)現(xiàn)（Lee等，1989），它是一個(gè)分子量為4719D的肽，從豬腸中分離，屬于富含Pro－Arg的肽家族，不裂解野生型大腸桿菌，但對(duì)突變型K12有作用，其作用機(jī)制是通過(guò)阻斷蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而導(dǎo)致這些成分的降解。PR－39在一個(gè)單層囊泡中可以誘導(dǎo)鈣的降低和電流的線性增加，此誘導(dǎo)與肽濃度和膜上甘油磷酸酯（帶負(fù)電荷）有關(guān)。另外在豬小腸中，還發(fā)現(xiàn)另一種抗菌肽cecropin PI，它是以裂解細(xì)菌來(lái)完成殺菌作用的。Andersson（1995）運(yùn)用基因工程技術(shù)從豬骨髓RNA中克隆到一種新型的CDNA，其編碼一個(gè)78殘基的抗菌肽NK－lysin，有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，這種肽對(duì)NK一敏感型的腫瘤細(xì)胞株YAC－1有裂解活性，但不裂解紅血球細(xì)胞。而在綿羊中至少已發(fā)現(xiàn)10種抗菌肽；牛中至少已發(fā)現(xiàn)30種抗菌肽；另外，牛奶中也分離到3種抗菌肽，它們具有抑制腸毒性大腸桿菌和單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的生長(zhǎng)的作用。

在水生動(dòng)物中，Schnapp等（1996）從青圓蟹（Carcinus maenas）的血細(xì)胞中分離到3種具有殺菌作用的肽，并對(duì)其中的一個(gè)6.5 kD的抗菌肽進(jìn)行部分序列分析。從不同種鱟的血細(xì)胞中也分離到多個(gè)抗菌肽，發(fā)現(xiàn)它們具有與其他昆蟲(chóng)、蛙和哺乳類動(dòng)物抗菌肽共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即由于多個(gè)精氨酸和賴氨酸殘基的存在而帶陽(yáng)性電荷，形成兩親性二級(jí)結(jié)構(gòu)，能選擇性地作用于細(xì)菌外層細(xì)胞膜的某些組分，如帶陰離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，并具有與幾丁質(zhì)結(jié)合的活性等。 Park等報(bào)道了鯰（Parasiliuus asotus）受傷時(shí)上皮粘膜細(xì)胞層分泌一種分子量為 2 kD的抗菌肽Parasin I，具有廣譜強(qiáng)抗菌活性，沒(méi)有溶血作用，其抗菌活性是蚌皮素2的12～100倍。對(duì)水生甲殼動(dòng)物及魚(yú)類體內(nèi)抗菌肽的研究表明，抗菌肽是水生動(dòng)物防御系統(tǒng)的主要成分之一。
4  抗菌聯(lián)的基因工程
　　由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對(duì)分子量較小、熱穩(wěn)定、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是抗菌肽對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用，僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，在當(dāng)前不少病原菌對(duì)原有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性時(shí)，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗菌肽功能的了解以及設(shè)計(jì)一種方法來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)自然抗菌肽的功能以替代抗生素的研究便顯得極為重要。其中通過(guò)抗菌肽基因的克隆與表達(dá)而大量生產(chǎn)抗菌肽是一種較為直接而有效的方法。目前昆蟲(chóng)和植物抗菌肽基因工程，在國(guó)內(nèi)外已有不少成功的報(bào)道，但畜禽抗菌肽基因工程國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，運(yùn)用基因工程技術(shù)，通過(guò)對(duì)畜禽及水生動(dòng)物抗菌肽的研究，以提高畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的抗病能力，將對(duì)減少甚至替代抗生素的使用起到積極的促進(jìn)作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗菌肽在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用前景將十分廣闊。
抗菌肽前景廣闊的新型抗生素
   隨著抗生素的長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用，病原菌耐藥性也日趨嚴(yán)重.;
   廣譜抗菌，殺菌力強(qiáng)，尤能殺耐藥菌
   自發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，抗生素一直是人類治療病原微生物感染疾病的有力武器，但隨著抗生素的長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用，病原菌耐藥性的形成也日趨嚴(yán)重，迫切要求開(kāi)發(fā)新型抗生素，而且前從微生物中尋找新生物的難度已愈來(lái)愈大。來(lái)源于動(dòng)物的抗菌肽(也稱為殺菌肽，動(dòng)物多肽抗生素)的發(fā)現(xiàn)，為開(kāi)發(fā)新型抗生素提供了新的廣闊的來(lái)源。近年來(lái)，對(duì)抗菌肽的理論和應(yīng)用研究獲得了迅速發(fā)展。
   抗菌肽的發(fā)現(xiàn)起源于對(duì)昆蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究，當(dāng)昆蟲(chóng)受到外界刺激時(shí)，發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生出具有強(qiáng)烈抗菌活性的物質(zhì)，抗菌肽是其中重要組成成份。后來(lái)，又在兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物中分離得到類似的具有抗菌活性的多肽，使人們對(duì)抗菌肽的起源及其在進(jìn)化中的作用有了新的認(rèn)識(shí)。隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能、抗菌肽-生物膜相互作用機(jī)理、抗菌肽基因的分子生物學(xué)、抗菌肽基因工程等研究的深入進(jìn)行，抗菌肽在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

抗菌肽的概念和分類
   抗菌肽原指昆蟲(chóng)體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類分子量在4KD左右，具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。最初，人們?cè)谘芯勘泵捞煨Q的免疫機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)其滯育蛹經(jīng)外界刺激誘導(dǎo)后，其血淋巴中產(chǎn)生了具有抑菌作用的多肽物質(zhì)，這類抗菌多肽被命名為天蠶素(Cecropins)。后來(lái)，從其他昆蟲(chóng)以及兩棲類動(dòng)物、哺乳動(dòng)物中，也分離到結(jié)構(gòu)相似的抗菌多肽。迄今為止，在不同動(dòng)物組織中已發(fā)現(xiàn)了很多具有抗菌作用的蛋白質(zhì)和多肽，已有70多種抗菌多肽的結(jié)構(gòu)被測(cè)定，抗菌肽的概念得到了極大的擴(kuò)展。
   根據(jù)抗菌肽的結(jié)構(gòu)，可將其分為5類：(1)單鏈無(wú)半胱氨酸殘基的α-螺旋，或由無(wú)規(guī)卷曲連接的兩段α-螺旋組成的肽；(2)富含某些氨基酸殘基但不含半胱氨酸殘基的抗菌肽；(3)含1個(gè)二硫鍵的抗菌多肽；(4)有2個(gè)或2個(gè)以上二硫鍵、具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽；(5)由其它已知功能的較大的多肽衍生而來(lái)的具有抗菌活性的肽。其中最早分離到的Cecropins和從非洲爪蟾中分離到的Magainins等屬于第一類抗菌肽，通常也將其稱為Cecropin類抗菌肽，目前對(duì)此類抗菌肽的研究也較深入。

抗菌肽的生物學(xué)效應(yīng)
   抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是其對(duì)某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。
   除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對(duì)部分病毒、真菌、原蟲(chóng)和癌細(xì)胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合過(guò)程。
   抗菌肽的廣泛的生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景。

抗菌肽的作用機(jī)制
   自從發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來(lái)，已對(duì)抗菌肽的作用機(jī)理進(jìn)行了大量研究。目前已知的是，抗菌肽是通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜而起作用的，在此基礎(chǔ)上，提出了多種抗菌肽與細(xì)胞膜作用的模型。但嚴(yán)格地說(shuō)，抗菌肽以何種機(jī)制殺死細(xì)菌至今還沒(méi)有完全弄清楚。
   目前一般認(rèn)為,Cecropin類抗菌肽作用于細(xì)胞膜，在膜上形成跨膜的離子通道，破壞了膜的完整性，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而殺死細(xì)胞。
   對(duì)于抗菌肽破壞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)外屏障喪失，從而殺死細(xì)菌這一觀點(diǎn)已得到基本統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但對(duì)其具體作用過(guò)程、是否存在特異性的膜受體、有無(wú)其它因子協(xié)同等問(wèn)題尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌肽的作用機(jī)制可能不一樣，尚有待進(jìn)一步研究。

抗菌肽基因工程
   抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)含量極微。從動(dòng)物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這成為制約抗菌肽進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用的最大障礙。因此，開(kāi)展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。
   目前，已進(jìn)入臨床應(yīng)用的基因工程藥物多數(shù)是采用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的，但由于抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用，不能用原核表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表達(dá)，將給表達(dá)產(chǎn)物的后處理帶來(lái)很大麻煩。因此，國(guó)內(nèi)外的研究者多采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行抗菌肽基因工程研究。

   近年來(lái)，以酵母為基因工程受體菌的研究引起人們的重視，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。自1978年Hinnen等首先試驗(yàn)酵母轉(zhuǎn)化成功后，已有人干擾素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等數(shù)十種外源基因在酵母中獲得表達(dá)。國(guó)內(nèi)研究者大量研究表明，利用酵母表達(dá)抗菌肽是一條可行的道路，如能在表達(dá)產(chǎn)率上得到進(jìn)一步提高，將為抗菌肽早日進(jìn)入臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

lirong0805

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