甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)ＶＢ１２的影響

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甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)ＶＢ１２的影響
                          來源：中國論文下載中心    [ 08-11-27 13:36:00 ]    編輯：studa0714


                                                  王振國　曹云峰　陳學(xué)軍　李永亮　李昆太　張嗣良
    [摘要] 通過研究不同甲基供體（甜菜堿和氯化膽堿）對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響，結(jié)果表明甜菜堿能顯著促進(jìn)VB12的生物合成；在此基礎(chǔ)上考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中甜菜堿濃度對VB12合成的影響，結(jié)果表明15 g/L的甜菜堿下VB12的合成量最高；進(jìn)一步研究了甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響，結(jié)果表明發(fā)酵液中一定濃度的甜菜堿可以顯著提高δ-氨基乙酰丙酸的合成量，從而促進(jìn)VB12的合成。
　　[關(guān)鍵詞] 甜菜堿；菌體生長；VB12合成；δ-氨基乙酰丙酸；脫氮假單胞桿菌
　　
　　[Abstract] The effect of different methyl-group donors (betaine and choline chloride) on vitamin B12 production in shake flasks with Pseudomonas denitrificans was studied, and the results demonstrated that the addition of betaine to the fermentation medium could greatly stimulate biosynthesis of vitamin B12. Betaine concentration in fermentation medium was further investigated in shake flask, as a result, 15 g/L of betaine was the most beneficial for vitamin B12 synthesis. Moreover, the effect of betaine on the fermentation of P. denitrificans was studied, it was found that the δ-aminolevulinic acid (ALA) biosynthesis could be significantly improved when betaine was kept at certain concentration in the broth, thus the biosynthesis of vitamin B12 was greatly increased.
　　[Key words] Betaine;Cell growth;Vitamin B12 biosynthesis;δ-aminolevulinic acid,;Pseudomonas denitrificans
　　
　　維生素B12（VB12）通常用來表示鈷胺素類化合物，它是一種重要的生物活性物質(zhì)，可以用來治療惡性貧血癥，同時也是許多微生物和動物的生長因子[1]。自然界中，VB12的生物合成存在兩種不同的途徑，即好氧途徑和厭氧途徑，但是VB12的生物合成嚴(yán)格局限于一些微生物中[2]，目前用于商業(yè)化生產(chǎn)VB12的微生物主要有謝氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）、菲氏丙酸桿菌（P. freudenreichii）和脫氮假單胞桿菌（Pseudomonas denitrificans）等。P. denitrificans好氧合成VB12的途徑已經(jīng)詳細(xì)闡明[3]。正是由于對VB12合成途徑的了解，所以可以通過誘變和分子生物學(xué)等手段來改造菌株，已經(jīng)使得P. denitrificans菌株的VB12生產(chǎn)能力大大提高[2]。由于VB12產(chǎn)率高, 目前在工業(yè)生產(chǎn)中幾乎都是使用P. denitrificans來作為好氧生產(chǎn)VB12的工業(yè)菌株。P. denitrificans好氧合成VB12的過程一共需要8步甲基化[4]。氯化膽堿（氯化-β-羥乙基-N,N,N-三甲基銨）和甜菜堿（三甲基甘氨酸）的每個分子含有三個甲基，它們通常作為生物合成VB12的甲基供體。White等 [5]第一次報道在P. denitrificans中，甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶對VB12的大量合成具有非常重要的作用。甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶催化甜菜堿向高半胱氨酸轉(zhuǎn)移一個甲基，分別形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[6]，因此甜菜堿在參與VB12生物合成過程中的甲基化具有非常重要的作用。Demain等[7-9]的研究表明，甜菜堿對P. denitrificans中VB12的合成和卟啉的過量生成起著重要的作用。另外，甜菜堿是一種良好的滲透壓調(diào)節(jié)劑[10]，有文獻(xiàn)報道甜菜堿和膽堿能促進(jìn)細(xì)胞表面對代謝產(chǎn)物的分泌，從而對細(xì)菌產(chǎn)VB12具有刺激效果[11]。
　　甜菜堿在VB12發(fā)酵過程中具有非常重要的作用，但是目前很少有文獻(xiàn)對甜菜堿所引起的P. denitrificans代謝變化情況進(jìn)行分析。本文主要考察了甜菜堿對P. denitrificans菌體生長和VB12合成的影響，并通過研究發(fā)酵過程pH和δ-氨基乙酰丙酸（ALA）合成量的變化，闡明了甜菜堿所引起的P. denitrificans代謝特征，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)VB12中的甜菜堿控制工藝提供了重要依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 菌種和培養(yǎng)基
　　菌種：脫氮假單孢桿菌（Pseudomonas denitrificans），石藥集團(tuán)河北華榮制藥有限公司。種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 40，酵母膏 10， NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，pH 7.2~7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 80，酵母膏 30，(NH4)2HPO4 3.0，MgSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI） 0.05，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，pH7.0～7.2。
　　1.2 儀器與試劑
儀器：8453型紫外-可見分光光度計（Agilent公司）；HP 1100型色譜儀(Agilent公司)。
　　試劑：氰鈷胺對照品(含量＞99％，河北華榮制藥有限公司)，糖蜜（內(nèi)蒙古蘭田糖業(yè)有限公司），甜菜堿(河北華榮制藥有限公司)，DMBI(河北科碩化工有限公司)，CoCl2·6H2O(山東臨縣匯豐鈷廠)，ALA (Sigma公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
　　1.3 發(fā)酵培養(yǎng)方法
　　種子培養(yǎng)：用無菌水刮洗下斜面菌體，制成菌懸液。取1 ml菌懸液接入裝有60 ml種子培養(yǎng)基的300 ml三角瓶中，30 ℃，260 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)至菌體吸光值(OD700)為10左右。搖瓶培養(yǎng)：300 ml三角瓶中培養(yǎng)基裝量為36 ml，接種量10％，32 ℃，于旋轉(zhuǎn)式搖床（260 r/min）培養(yǎng)至96 h。
　　1.4測定方法
　　菌體濃度(DCW)：采用測量菌體干重法(dry cell weight)。吸10 ml發(fā)酵液，經(jīng)離心和洗滌后，菌體烘干至恒重，稱菌體干重。VB12測定：采用HPLC法。將被測樣品中不同形式的VB12轉(zhuǎn)化為氰鈷胺，流動相：V（250 mmol/L磷酸水溶液）∶V（乙腈）= 30∶70；色譜柱：大連依利特Hypersil NH2柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；檢測波長：361 nm；進(jìn)樣量：20 μl；流速：1.7 ml/min。甜菜堿測定：比色法[12]，利用甜菜堿與雷氏鹽發(fā)生反應(yīng)。δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的測定：按照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測定。
　　2 結(jié)果與討論
　　2.1 兩種不同甲基供體對菌體生長和VB12合成的影響
　　甜菜堿和氯化膽堿每個分子都含有三個甲基，常常作為發(fā)酵產(chǎn)VB12過程的甲基供體。為了比較二者對P. denitrificans發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入10 g/L的甜菜堿、氯化膽堿，結(jié)果如圖1所示：



　　
　　圖1不同甲基供體對P. denitrificans發(fā)酵過程的影響
　　Fig. 1The effects of different methyl-group donors on cell growth（solid）(a), broth pH (dash) (a) and VB12 synthesis (b) of P. denitrificans in shake flask
　　
　　由圖1a可見，發(fā)酵培養(yǎng)基使用甜菜堿的菌體生長量明顯要高于使用氯化膽堿，其最大DCW分別為23.04 g/L和18.79 g/L。使用甜菜堿作為甲基供體，發(fā)酵過程中的pH較為穩(wěn)定，一直維持在7.0左右。而使用氯化膽堿作為甲基供體，發(fā)酵液的pH急劇下降，第48小時后pH降低至5.0左右，pH的下降很可能是由于氯離子積累而造成的。
　　由圖1b可見，使用氯化膽堿的VB12效價明顯低于使用甜菜堿的VB12效價，二者放瓶時（96 h）的VB12效價分別為20.75 μg/ml和48.45 μg/ml。
　　2.2 甜菜堿濃度對VB12合成的影響
　　在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甜菜堿，濃度分別為0、5、10、15、20、30 g/L。發(fā)酵96 h后放瓶，結(jié)果見圖2。
　　圖2 不同濃度的甜菜堿對VB12合成的影響
　　Fig 2. Effect of betaine on the cell growth and vitamin B12 biosynthesis of P. denitrificans
　　
　　從圖2可以看出，在P. denitrificans發(fā)酵過程中，添加一定量的甜菜堿是十分必要的，它對VB12的合成具有明顯的促進(jìn)作用。發(fā)酵培養(yǎng)基不加甜菜堿，雖然得到最大的菌體生物量，但是沒有VB12的合成。添加15 g/L甜菜堿的效果最好，VB12的效價達(dá)到52.18 μg/ml。
　　2.3 甜菜堿對P. denitrificans發(fā)酵過程的影響
　　為了研究甜菜堿對P. denitrificans發(fā)酵過程的影響，選擇15 g/L和30 g/L的甜菜堿在搖瓶中作進(jìn)一步實驗，以不加甜菜堿作為對照。
2.3.1甜菜堿對pH和菌體生長的影響圖3為這三種不同濃度甜菜堿下，發(fā)酵過程的pH和菌體生長變化趨勢。
　　圖3不同濃度甜菜堿下發(fā)酵過程的pH和菌體生長變化趨勢
　　Fig. 2 Time course of pH (a) and cell growth (b) under various concentrations of betaine in shake flask culture by P. denitrificans.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　由圖3a可見，培養(yǎng)基中不加甜菜堿，pH在第24小時后明顯下降，而加入15 g/L和30 g/L的甜菜堿，pH較為穩(wěn)定。圖3b顯示的生物量變化表明，培養(yǎng)基中不加甜菜堿，菌體生長最快。此外，15 g/L甜菜堿下的菌體量明顯高于30 g/L甜菜堿下的菌體量。
　　2.3.2 甜菜堿對ALA和VB12合成的影響圖4為這三種不同濃度甜菜堿對發(fā)酵過程ALA和VB12合成的影響結(jié)果。
　　由圖4a可見，培養(yǎng)基中不加甜菜堿，發(fā)酵液中的ALA含量明顯低于15 g/L和30 g/L甜菜堿下的ALA含量。在72 h前，15 g/L甜菜堿下的ALA含量還略高于30 g/L甜菜堿下的ALA含量。由圖4 b可見，培養(yǎng)基中不加甜菜堿，整個發(fā)酵過程的VB12合成量為0。由于15 g/L甜菜堿下的菌體生長較快，其VB12效價明顯高于30 g/L甜菜堿下的VB12效價。
　　2.3.3 發(fā)酵過程甜菜堿的變化趨勢圖5為P. denitrificans發(fā)酵過程中甜菜堿含量的動態(tài)變化。
　　
　　圖5 發(fā)酵液中甜菜堿濃度的動態(tài)變化過程
　　Fig. 5 The dynamic change of betaine concentrations by the fermentation of P. denitrificans in shake flasks.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　從圖5的甜菜堿的動態(tài)變化情況可以看出，在第48小時到第72小時期間，甜菜堿利用量最大。培養(yǎng)基加入15 g/L甜菜堿時，在放瓶時（第96小時）發(fā)酵中甜菜堿濃度降低到0.19 g/100 ml，這說明15 g/L的甜菜堿剛好滿足發(fā)酵過程對甜菜堿的需求，不會因為甜菜堿的不足而影響VB12的合成。但是隨著培養(yǎng)基中甜菜堿濃度增大，反而會因為甜菜堿過量而影響VB12的合成，而且這對發(fā)酵成本的控制也是很不利的。
　　3討論
　　3.1 關(guān)于P. denitrificans好氧合成VB12過程中甲基供體的選擇
　　從兩種甲基供體對發(fā)酵過程的影響可以說明，使用氯化膽堿作為甲基供體，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH迅速下降，抑制了菌體生長和VB12合成過程中酶的活性，從而導(dǎo)致VB12合成速率下降。因此，選用甜菜堿作為P. denitrificans發(fā)酵產(chǎn)VB12的甲基供體是VB12發(fā)酵過程中很好的甲基供體。P. denitrificans發(fā)酵產(chǎn)VB12的過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的甲基供體能顯著促進(jìn)VB12的生物合成。而使用甜菜堿作為P. denitrificans發(fā)酵過程中的甲基供體，對發(fā)酵過程的pH控制和VB12的合成效率，都要明顯優(yōu)于使用氯化膽堿。
3.2 關(guān)于甜菜堿作為甲基供體對P. denitrificans好氧合成VB12發(fā)酵過程的影響和在發(fā)酵過程中的使用
　　從甜菜堿對發(fā)酵過程的影響可以看出隨著甜菜堿濃度的增加，菌體量逐漸下降，這說明甜菜堿對菌體的生長有一定的抑制作用。培養(yǎng)基中不加甜菜堿，可能由于菌體生長代謝旺盛，糖耗加快（數(shù)據(jù)未列出），從而造成pH下降迅速。而甜菜堿對菌體的生長具有一定抑制作用，所以pH不會因菌體生長過快而明顯下降。
　　在P. denitrificans好氧合成VB12的途徑中， ALA是生成咕啉環(huán)的關(guān)鍵前體物，ALA 合成酶對ALA的合成起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，它也是整個VB12合成途徑的關(guān)鍵酶之一[4]。Fa等[14]的研究表明，甜菜堿能顯著提高ALA合成酶的活性。由圖5的ALA和VB12變化可以推斷，由于甜菜堿能促進(jìn)ALA合成酶活性的提高，從而促進(jìn)了ALA和VB12的合成。但是發(fā)酵液中甜菜堿濃度過高，會對菌體的生長產(chǎn)生一定抑制作用，反而會減少ALA合成量，從而降低VB12的合成。
　　本實驗的結(jié)果還顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基中甜菜堿濃度的高低不僅影響到ALA和VB12的合成，而且對P. denitrificans的菌體生長也會產(chǎn)生較大的影響。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的甜菜堿濃度過高，會對菌體的生長產(chǎn)生較大的抑制作用，反而更加不利于VB12的合成。
　　鑒于P. denitrificans合成VB12對甜菜堿的需求以及甜菜堿對菌體生長的抑制作用，因此，在P. denitrificans產(chǎn)VB12的發(fā)酵過程中，可以采用甜菜堿補(bǔ)加工藝。通過甜菜堿的補(bǔ)加，在滿足VB12合成所必需的甜菜堿用量的基礎(chǔ)上，又不會因發(fā)酵液中甜菜堿濃度過高而影響菌體的生長。
　　[參考文獻(xiàn)]
　　[1]Hunik JH.Process for the production of vitamin B12[J].US Patent，2002.
　　[2]Martens J H, Barg H, Warren MJ, et al. Microbial production of vitamin B12 [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58: 275-285.
　　[3]Warren MJ, Evelyne R, Schubert HL, et al. The biosynthesis of adenosylcobalamin (vitamin B12 ) [J]. Nat Prod Rep, 2002, 19: 390-412.
　　[4]Battersby AR, Leeper FJ. Biosynthesis of vitamin B12[J]. Topics in Current Chemistry, 1998, 195:143-193.
　　[5]White RF, Kaplan L, Birnbaum J. Betaine-homocysteine transmethylase in Pseudomonas denitrificans, a vitamin B12 overproducer[J]. J. Bacteriol, 1973, 113: 218-223.
　　[6]Mulligan JD, Laurie TJ, Garrow TA. An assay for betaine-homocysteine methyltransferase activity based on the microbiological detection of methionine[J]. Methods of Nutritional Biochemistry, 1998, 9: 351-354.
　　[7]Demain AL, Daniels HJ, Schnabel L, et al. Specificity of the stimulatory effect of betaine on the vitamin B12 fermentation[J]. Nature(london), 1968, 220: 1234-1235.
　　[8]Demain AL, White RF. Porphyrin overproduction by Pseudomonas denitrificans:essentiality of betiane and stimulation by ethionine [J]. J. Bacteriol, 1971, 107: 456-460.
　　[9]White RF, Demain AL. Catabolism of betaine and its relationship to cobalamine overproduction [J]. Biochim.Biophys, 1971, 237: 112-119.
　　[10]Felitsky DJ, Cannon JG, Capp MW, et al. The exclusion of glycine betaine from anionic biopolymer surface: why glycine betaine is an effective osmoprotectant but also a compatible solute[J]. Biochemistry, 2004,43: 14732-14743.
　　[11]Vandamme E J. Production of vitamins, coenzymes and related biochemicals by biotechnological process[J]. J Chem Technol Biotechnol, 1992, 53(4): 313-327.
　　[12]崔艷紅,黃現(xiàn)青. 甜菜堿含量測定與工業(yè)制備方法研究 [J]. 畜牧業(yè), 2002,6:38-40.
　　[13]Burnham BF. δ-aminolevulinic acid sythase [J]. Methods in Enzymology, 1970, 17A: 195-200.
　　[14]Fa YH, Kusel JP, Demain AL. Dependence of betaine stimulation of vitamin B12 overproduction on protein synthesis [J]. Appl Environ Microbial, 1984, 47: 1067-1069.
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