甜菜堿藥物分析進(jìn)展

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甜菜堿藥物分析進(jìn)展

關(guān)鍵詞】
甜菜堿
提取分離
定量
高效液相色譜法

甜菜堿（betaine，Bet）又名甘氨酸甜菜堿、甜菜素，化學(xué)名稱是三甲基氨基乙酸或三甲銨乙內(nèi)酯，19世紀(jì)最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，是一種季銨型水溶性生物堿，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)。其分子式為C5H11NO2，結(jié)構(gòu)式為（CH3）3N+CH2COO?，外觀物理形狀呈流動(dòng)性，為鱗狀或棱狀白色結(jié)晶，易溶于水和甲醇，由于常溫時(shí)極易吸濕潮解，應(yīng)用時(shí)常將其制成甜菜堿鹽酸鹽（鹽酸甜菜堿）。自上世紀(jì)70年代以來，甜菜堿的研究漸成熱點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于畜牧、醫(yī)藥、農(nóng)林、食品和日化等領(lǐng)域。特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，甜菜堿許多優(yōu)良的藥理作用被相繼發(fā)現(xiàn)，可用于對(duì)抗高同型半胱氨酸綜合癥，能保肝護(hù)腎、保持心臟與血管健康、維護(hù)消化系統(tǒng)、抑瘤抗癌、降壓鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、耐缺氧、保護(hù)細(xì)胞抵抗高滲等等。體內(nèi)組織或排泄物中甜菜堿的測(cè)定有助于臨床上診斷人體內(nèi)代謝異常與否［1］，許多甜菜堿藥效研究需要對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，這都涉及到甜菜堿的分析測(cè)定。如何更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)地從生物樣品中分離并定量甜菜堿，一直是學(xué)者們努力的方向。

    1   從生物樣品中提取分離甜菜堿

基于甜菜堿的溶解性特點(diǎn)，從生物樣品中提取甜菜堿最常用的方法有水提和醇提兩種，如Hitz和Hanson［2］將生物樣品90℃水浴1h，冷卻后研磨，2 ℃去離子水浸提共3次，最后65 ℃減壓濃縮；最早提出提取甜菜堿方法的Pearce等［3］使用甲醇對(duì)生物樣品反復(fù)提取3次，然后于65 ℃減壓濃縮。國(guó)內(nèi)有用堿性三氯甲烷提取甜菜堿的報(bào)道［4］,樸茨茅斯大學(xué)的楊昕等［5］則采用了混合提取法，將甲醇?氯仿?0.2 mol·L?1碳酸氫鉀（12：5：1 v/v）加入生物樣品，60 ℃分別提取2次，然后用甲醇?水（1：1 v/v）60 ℃加熱提取，取得較好效果。

基于甜菜堿的兩性季銨型生物堿的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)其分離純化大多使用離子交換法。該方法是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同,經(jīng)過交換平衡達(dá)到分離目的的一種柱色譜法［6］。Horst［7］、劉新亞等［8］、尹昆等［9］分離提純甜菜堿均使用了此類方法，都是將提取液依次通過強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂，最后用氫氧化銨洗脫。此法能除去提取液中的氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖和苷類等成分，最終使測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。吳志榮［10］、楊東輝［11］則利用了薄層層析法來分離純化甜菜堿，但如何選擇優(yōu)良的展開劑、顯色劑仍是制約該法的一個(gè)瓶頸。另外谷大建等［12］采用Oasis HLB固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行純化，得到較好的效果。

    2  甜菜堿定量分析方法

對(duì)于甜菜堿的定量測(cè)定，自Pearce等發(fā)布碘量法［3］以來，又出現(xiàn)了可見一紫外分光光度法［13?14］、薄層掃描法［15］、非水滴定法［16］等許多分析方法，目前的主流方法是高效液相色譜（HPLC）法。

    2.1  高效液相色譜（HPLC）法

該法準(zhǔn)確、快速，再現(xiàn)性高，可連續(xù)進(jìn)樣，能滿足體內(nèi)藥物分析大樣本快速分析要求。根據(jù)選用色譜柱、檢測(cè)器種類及是否對(duì)甜菜堿進(jìn)行衍生化，目前HPLC法大致分為以下幾種方案。

    2.1.1  反相C18柱?紫外檢測(cè)器?直接測(cè)定

陳少良等［17］在測(cè)定甜菜堿時(shí)采用的流動(dòng)相為50 mmol·L?1KH2PO4(pH4.45)和0.1%PIC B_8(辛烷磺酸)，流速0.7 ml·min?1,檢測(cè)波長(zhǎng)為192 nm，測(cè)得甜菜堿的保留時(shí)間為6.3 min,加樣回收率達(dá)到90 %左右；尹昆等［9］、谷大建等［12］均采用類似的方法，測(cè)得甜菜堿保留時(shí)間分別為2.5 min、4.01 min，加樣回收率在90%以上。

    2.1.2  LC?SCX、CLC?ODS柱?紫外檢測(cè)器?甜菜堿衍生化后測(cè)定

基于甜菜堿在近紫外區(qū)測(cè)定干擾大，保留時(shí)間短的特點(diǎn)，人們采用先將其衍生化再測(cè)定的方法。Laryea等采用［18］?冠醚?6及4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑與樣品和KH2PO4混勻后80 ℃加熱60 min，制得甜菜堿的衍生物，使用強(qiáng)酸性陰離子交換色譜柱（LC?SCX），流動(dòng)相為乙腈?水（90：10 v/v），10 mmol·L?1膽堿，流速1.5 ml·min?1,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm來測(cè)定血樣和尿樣中的甜菜堿含量，發(fā)現(xiàn)衍生物保留時(shí)間為14.8 min，檢測(cè)最低限為5 μmol·L?1，效果良好。Lever等［19］、Mar MH等［20］亦采用這種方法對(duì)甜菜堿進(jìn)行了成功檢測(cè)。許明旺等［21］則采用了18?冠醚?6及2，4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑，使用CLC?ODS色譜柱，流動(dòng)相為乙腈?水(35：65,其中含有0.1 mol/L的NaClO4),流速1 ml·min?1,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，測(cè)得衍生物保留時(shí)間為13 min，加樣回收率在95%以上。姚少威等［22］采用相同的方法檢測(cè)了復(fù)方枸杞顆粒中的甜菜堿含量，加樣回收率亦在95%以上。

    2.1.3  胺基柱?紫外檢測(cè)器?直接測(cè)定

廖國(guó)玲等［23］采用Lichrospher NH2色譜柱，以乙腈?水(85：15 v/v)為流動(dòng)相，流速0.7 ml·min?1，檢測(cè)波長(zhǎng)195 nm，測(cè)定枸杞中甜菜堿，保留時(shí)間為16.58 min，平均回收率為98.9%，方法較為簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好。

    2.1.4  胺基柱?蒸發(fā)光檢測(cè)器?直接測(cè)定

基于甜菜堿在近紫外區(qū)測(cè)定干擾大的特點(diǎn)，龔立冬等［24］使用蒸發(fā)光檢測(cè)器代替紫外檢測(cè)器，采用Waters Spherisorb S5 NH2色譜柱，流動(dòng)相為0.1％(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸水溶液?甲醇(l5：85 v/v)，流速為0.6 ml·min?1，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中漂移管溫度90 ℃，測(cè)定肉蓯蓉中的甜菜堿，加樣回收率達(dá)到99%以上。李向陽(yáng)等［4］也采用胺基柱、蒸發(fā)光檢測(cè)器，流動(dòng)相為乙腈?水(25：75 v/v)，流速1.0 ml·min?1，漂移管溫度50 ℃，進(jìn)行甜菜堿含量測(cè)定，加樣回收率在97%以上。

    2.2  其他分析方法

    2.2.1  可見一紫外分光光度法

這種方法應(yīng)用較早，主要利用樣品與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)而生成有色物質(zhì)，以便使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。Barak等［13?14］處理后的肝組織樣品與冷卻的KH2混合產(chǎn)生碘化物沉淀，離心后用二氯乙烷溶解沉淀，在365 nm處測(cè)定吸光度，通過工作曲線計(jì)算出了甜菜堿含量。但該法干擾因素較多，特別是在測(cè)定低含量樣品時(shí)誤差較大。

    2.2.2  薄層掃描法

郭輝等［15］用0.5%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板,以氯仿?甲醇?甲酸?水(2：8：2.2：0.5)為展開劑，以改良碘化泌鉀溶液為顯色劑，掃描波長(zhǎng)為498 nm，對(duì)肝腎滋中的甜菜堿含量進(jìn)行了測(cè)定。其最低檢出限為22.8 μg，加樣回收率在95 %以上。由于操作中難以保持展開溫度、展開劑極性及蒸氣壓等諸多條件的恒定，該法重現(xiàn)性并不是很理想。

    2.2.3  非水滴定法

這是一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的測(cè)定方法，齊永秀等［16］以冰醋酸作為溶媒,以結(jié)晶紫作為指示劑,使用0.1 mol·L?1標(biāo)準(zhǔn)高氯酸溶液滴定并考察了不同廠家生產(chǎn)的鹽酸甜菜堿的純度，平均回收率為99.81%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.19%。該法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好，但無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。

    2.2.4  微型電極法

國(guó)外學(xué)者［25］曾用此法測(cè)定了甲基胺混合物中甜菜堿的含量。該法以甘汞電極為參比電極,玻璃微型電極為測(cè)定電極,用雙靜電計(jì)記錄電壓的方法測(cè)定甜菜堿含量,具有響應(yīng)快、靈敏度高的特點(diǎn)，但前處理過程麻煩，也無法滿足大樣本連續(xù)分析的要求。

    2.2.5  質(zhì)譜法與核磁共振法

質(zhì)譜法通常與氣相色譜儀或液相色譜儀聯(lián)用來達(dá)到理想分離與精密測(cè)定的效果。Holm等［26］使用這種方法對(duì)血漿中的甜菜堿、膽堿、二甲基甘氨酸進(jìn)行了測(cè)定。國(guó)外學(xué)者還利用1H NMR法測(cè)定了病人尿樣中的甜菜堿［27］。不可否認(rèn)這兩種方法具有較高的精確性與靈敏度，但儀器較為昂貴，難以在大范圍內(nèi)推廣。

    3  小
結(jié)

對(duì)甜菜堿的提取分離應(yīng)結(jié)合具體生物樣品及檢測(cè)手段，隨著檢測(cè)手段的改進(jìn)，提取分離也將趨向簡(jiǎn)單化、自動(dòng)化。提取一般使用水、甲醇，而分離純化一般使用離子交換樹脂法，更為簡(jiǎn)單的SPE(固相萃取)法也將得到廣泛應(yīng)用。對(duì)甜菜堿進(jìn)行測(cè)定一般使用HPLC法?；谔鸩藟A的強(qiáng)極性特點(diǎn)，分析柱的選擇越來越傾向于使用胺基柱，它能克服甜菜堿保留時(shí)間短，干擾大的缺點(diǎn)；對(duì)于僅配有紫外檢測(cè)器的實(shí)驗(yàn)室來講，從檢測(cè)效果看衍生化法具有一定優(yōu)勢(shì)，國(guó)外尤為盛行，但操作復(fù)雜；如若克服使用近紫外檢測(cè)干擾大的缺點(diǎn)，蒸發(fā)光檢測(cè)器不失為一種良好選擇。一般實(shí)驗(yàn)室如處理樣品樣本量少、對(duì)自動(dòng)化要求不高，則非水滴定法、微型電極法可滿足條件，且靈敏度較為理想。

secwind

好資料，謝謝LZ

波縱天下

東西已經(jīng)分析到實(shí)質(zhì)了。