三顆針活性成分——鹽酸小檗堿含量的有效測定方法

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　　三顆針活性成分——鹽酸小檗堿含量的有效測定方法

　　李蔥曉1 王志祥1 宋宏曉2 劉素梅3 劉建華1　 趙蕾1

　　1.河南農業(yè)大學 河南鄭州 450002 　 2.河南省洛陽市動物疫病預防控制中心　河南洛陽　471002 3.河南省獸藥監(jiān)察所 河南鄭州 450008
　　摘要：建立用高效液相色譜法(HPLC)測定三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的方法。 方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，乙腈-0.03mol/mL磷酸二氫鉀(體積比為35：65)為流動相;檢測波長：345nm;流速：1mL/min-1;柱溫：25℃。結果：鹽酸小檗堿在2.138-106.9μg范圍內線性關系良好，r=0.999995;具有較好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度。結論：該方法準確、可靠、專屬性強，可作為三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的有效測定方法。
　　關鍵詞：鹽酸小檗堿;高效液相色譜法;三顆針
　　三顆針為小檗科(Berberidaceae)小檗屬(Beris)植物的俗稱，其含有的生物堿主要有小檗堿、小檗胺、巴馬亭、藥根堿等，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降脂調脂的作用。三顆針活性成分是河南農業(yè)大學綠色飼料實驗室擬開發(fā)的飼料添加劑。本實驗提取三顆針活性成分，采用HPLC測定其中鹽酸小檗堿的含量。為將三顆針活性成分開發(fā)為飼料添加劑的用量提供參考依據。
　　文獻報道[1]測定三顆針中鹽酸小檗堿的含量所采用的方法有紫外、薄層層析法，容量法等。但以上方法誤差大，經查閱資料[2]后，采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，并對測定方法進行方法學考查。
　　1 材料
　　1.1 儀器　Waters1525高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器;MILLI-Q型超純水系統(tǒng)，梅特勒320型酸度計，KQ-250DB型超聲波清洗器，METTLER AE240電子分析天平。
　　1.2 藥材　稱取三顆針根莖，置于10倍0.25%的硫酸溶劑中，在80℃烘箱中浸泡24小時，用4層紗布過濾，濾渣用6倍量硫酸同法再提取1次，合并濾液，加石灰乳調pH=11，靜置過夜，抽濾，濾液中加5%食鹽，靜置過夜，抽濾得濾餅，即三顆針活性成分粗品;粗品加30倍純化水，加熱煮沸5min，趁熱抽濾，濾液在60℃時，加入濃鹽酸調pH=1，靜置過夜，抽濾即得三顆針活性成分精品[3~6]。
　　1.3 試劑　乙腈為色譜純，其它為分析純。鹽酸小檗堿標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，編號為713。
　　2 方法
　　2.1 色譜條件　色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm);流動相：乙腈一0.03mol/mL磷酸二氫鉀(35：65);流速1mL/min-1;檢測波長345nm;柱溫：25℃，進樣量為10μL。
　　2.2 圖譜 對照品的HPLC圖譜見圖1，保留時間t=7.8min。供試品圖譜見圖2。兩圖譜的小檗堿峰基本一致，理論塔板數(shù)為8715。
　　作者介紹：李蔥曉。河南農業(yè)大學2005級研究生，專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學。
　　
　　2.3 對照品溶液的制備　精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.69mg，以甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中，即為0.2138mg/mL的儲備液。
　　2.4 供試品溶液的制備 精密稱取三顆針活性成分50mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液約20mL，超聲處理使其全部溶解，加甲醇溶液至刻度，搖勻;精密量取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，經0.25μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。依法制得1、2、3、4、5五個樣品溶液。
　　2.5 測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得結果。
　　3 實驗結果
　　3.1 線性關系考察
　　分別吸取儲備液適量，配制成濃度(μg/mL)為2、5、10、20、50、100的對照品溶液，按上述色譜條件，將不同濃度的標準品溶液進樣，測定。以峰面積(Y)為縱坐標，以進樣量X(mg)為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程Y=37073.15X-823.51，相關系數(shù)：r=0.999995，r2=0.999990，結果表明：鹽酸小檗堿在2.138-106.9μg之間呈良好線性關系，詳見表1。
　　表1 鹽酸小檗堿進樣量與峰面積線性關系考察結果

進樣量（μg）	2.138	5.345	10.69	21.38	53.45	106.9
峰面積	83965	198472	393925	785752	1980235	3963746

　　3.2 穩(wěn)定性實驗
　　隨機取1號樣品溶液，于0，0.5，1，2，4，8，12h進行含量測定，鹽酸小檗堿峰面積的相對標準偏差RSD=1.109%，穩(wěn)定性良好，詳見表2。
　　表2 　穩(wěn)定性實驗結果

時間（h）	0	0.5	1	2	4	8	12	RSD%
峰面積	757173	759784	758595	772199	780626	768004	768833	1.11

　　3.3 重現(xiàn)性實驗
　　將供試品 1、2、3、4、5進行平行測定，結果供試品中鹽酸小檗堿的平均含量為101.1%，鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.616%，結果表明重現(xiàn)性良好。詳見表3。
　　表3 重現(xiàn)性實驗結果

樣品編號	1	2	3	4	5	Mean%	RSD%
峰面積	757450	745261	744832	759419	764157	101.1	0.616

　　3.4 精密度實驗
　　精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液10μL測定，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，求得鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.246%，表明精密度良好，詳見表4。
　　表4　 　精密度實驗結果

進樣次數(shù)	1	2	3	4	5	RSD%
峰面積	757173	757727	761599	759784	757652	0.246

　　4 討論
　　4.1實驗結果顯示：河南農大綠色飼料實驗室擬開發(fā)飼料添加劑中鹽酸小檗堿的含量為101.1%，為其進一步的開發(fā)為飼料添加劑提供參考依據。
　　4.2實驗中所采用的色譜條件是在張晶，楊朝蓮及劉建華的實驗條件下進行改進的一種新的條件。[7~9]
　　4.3實驗所采用的色譜條件，供試品與標準品保留時間基本一致，此方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度均良好，可作為三顆針活性成分中鹽酸小檗堿含量的一種有效測定方法。
　　參考文獻
　　[1]王勤，馬志剛等.甘肅產三顆針植物中生物堿測定及分布狀況研究[J].分析測定學報2004,23(3):54-57.
　　[2]李亢宗，韓躍武.高效液相色譜法測定三顆針中生物堿的含量[J].蘭州醫(yī)學院學報，1994,20(1):1-2.
　　[3]廖志新，李玉林，紀蘭菊，孫洪發(fā).青海產三顆針中鹽酸小檗堿的最佳提取工藝研究[J].天然產物研究與開發(fā)，1997,10(2)：62-65.
　　[4]王水晶，王洪福.從野生植物三顆針中提取黃連素[J].綿陽師范高等專科學校學報，2001,20(5)：43-47.
　　[5]張福維，關崇新，高坤.鹽酸小檗堿提取實驗的改進[J].大學化學，2003,18(4)：47-49.
　　[6]袁麗，戴云花，何迎春，楊宏健，肖美鳳.正交實驗優(yōu)選三顆針中小檗堿的提取工藝[J].懷化醫(yī)專學報，2005,4(1)：34-36.
　　[7]張晶.HPLC法測定鹽酸小檗堿預混劑的含量[J].中國獸藥雜志，2006,40(7)：34-36.
　　[8]楊朝蓮，馮華，張運杰，武孔去，靳風云，梁光義.HPLC法測定三顆針中鹽酸小檗堿的含量[J].貴陽中醫(yī)學院學報，2005,27(3)：57-58.
　　[9]劉建華，王志祥，劉嶺.HPLC法測定中草藥飼料添加劑中鹽酸小檗堿含量[J].獸藥與飼料添加劑，2006,11(2)：29-30.

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