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飼料活性賴氨酸的幾種測定方法[1] 鄧敦 謝冰梅 唐時花 鄧躍林
賴氨酸(lysine, Lys)作為豬的第一限制性氨基酸,從20世紀(jì)50年代開始一直是動物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點之一。Lys在動物飼料中用量大、成本較高,因此必須精確地確定動物最佳生長發(fā)育的最低需要量。另一方面許多原料經(jīng)過加熱、加壓、磨粉、堿處理或貯存時間過長,均可導(dǎo)致Lys的є-氨基與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),形成脫氧酮糖化合物,該物質(zhì)雖能被動物吸收,但無營養(yǎng)價值(Eichner 等, 1994),從而導(dǎo)致部分Lys不能被動物利用。只有準(zhǔn)確評價Lys的有效率,才能合理利用Lys,從而避免蛋白質(zhì)資源的缺乏和浪費,減少動物對氮的排放和環(huán)境污染。準(zhǔn)確測定飼料和回腸末端食糜活性Lys含量,將有利于動物對Lys需要量的研究。
1 活性Lys(Reactive lysine)的定義
Lys的基本結(jié)構(gòu)為丙胺酸(如圖1),丙胺酸的β-碳原子上帶有一個丙胺基,ε-氨基比α-氨基具有較高的pKa(多肽為10.5),從而使得Lys側(cè)鏈的親核性下降。特殊環(huán)境作用能夠降低Lys側(cè)鏈的pKa,使之變得活躍?;钚訪ys是指Lys上的є-氨基能與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的Lys,可利用Lys是指食入的Lys能夠被動物吸收并可用于蛋白質(zhì)合成的Lys,可消化氨基酸是指食入的Lys經(jīng)消化后被吸收的Lys,從實用角度,可以把可消化Lys和可利用Lys同等對待,但活性Lys與可消化Lys或可利用Lys有著本質(zhì)的區(qū)別。
圖1 賴氨酸的基本結(jié)構(gòu)
2 活性Lys的測定方法
飼料活性Lys的測定方法有多種,每一種方法都有各自的優(yōu)缺點,許多研究者對各種方法分別進行了論述(見表1)。
2.1 1-F-2,4-二硝基苯法(FDNB法)
Carpenter(1960)用FDNB法連接Lys殘基,酸水解之后用分光光度計測定DNP-Lys含量,當(dāng)樣品含有碳水化合物時,會生成一些不穩(wěn)定的化合物,導(dǎo)致過高估計活性Lys含量(Matheson,1968)。Holm(1971)在碳水化合物水解時,試圖使用色譜法從受到干涉的氨基酸和其他化合物中分離出DNP-Lys。Peterson和Warthesen(1979]使用高效液相色譜來分析活性Lys,檢測波長為436 nm,C18毛細(xì)柱,20%乙氰和80% 0.01M醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)作為流動相,該法首先應(yīng)用在分析二硝基苯基化棉籽蛋白的水解產(chǎn)物。Catherine等(1997)[11]應(yīng)用上述方法未能很好地測定DNP-Lys,并得出DNP-Lys紫外線最大吸收峰在364 nm,而不是在436 nm,并對此分析方法做了改進,用20%乙氰和80%0.01M鄰苯二甲酸氫鉀緩沖劑(pH3.9)混合物作為流動相,在此條件下,DNP-Lys和其它化合物能很好地得到分離。Qin等(1998)報道,用FDNB法測定中國大豆和阿根廷大豆活性Lys,加熱到100℃和118 ℃時,F(xiàn)DNB-活性Lys變化規(guī)律不明顯,但當(dāng)加熱到136℃,兩種大豆中活性Lys含量隨加熱時間的延長而降低。近年來,很多學(xué)者用高效液相色譜法測定以谷物為主的嬰兒食物、嬰兒配方食品和其他食品DNP-Lys含量,但是沒有進一步與動物試驗結(jié)果進行比較(castillo等,1997;Alala-Hurtado等,1999;Fernandez-Artigas等1999;Hermandez等,2001)。
表1飼料原料活性賴氨酸的測定方法 方法 | 出處 | 1-F-2,4-二硝基苯法(FDNB) | Carpenter,1960 | 胍基反應(yīng)法 (Guanidination) | Mauron 和 Bujard,1964 | O-鄰苯二甲醛(OPA) | Goodno等,1981 | 化學(xué)計量染色法 | Ibolya 和Margit,1985 |
2.2 胍基反應(yīng)法 (Guanidination)
胍基反應(yīng)法是Mauron和Bujard(1964)建立一種活性Lys分析方法,這種方法根據(jù)ε-氨基在堿性條件下與鄰-甲基脲胍基反應(yīng)形成同型精氨酸,經(jīng)過水解后同型精氨酸可以用離子交換層析法測定,該測定方法盡管反應(yīng)時間較長(幾天)、溫度控制嚴(yán)格(室溫),但分析結(jié)果可靠,因此現(xiàn)在還普遍使用。Mao等(1993)用葡萄糖或堿處理大豆活性Lys,結(jié)果表明,與總Lys分析比較,葡萄糖處理組總Lys含量下降17%~40%,活性Lys含量下降78%~85%。用胍基反應(yīng)證實了熱堿處理損害活性Lys更為真實, 其原因是在酸水解時重新除去一些被反應(yīng)的Lys(如美拉德反應(yīng)起始物果糖-Lys)。Imbeah 等(1996)在酪蛋白和大豆粉中得到胍基反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件,得到可溶奶蛋白Lys轉(zhuǎn)化率為100%,大豆稍低于80%。 Ravindran(1996)等研究了飼料原料胍基反應(yīng),以確定內(nèi)源氨基酸的分泌量,主要集中棉籽蛋白最佳轉(zhuǎn)化的研究,64% Lys轉(zhuǎn)化為同型精氨酸。Moughan(1996) 在上述相同的試驗條件下,用胍基反應(yīng)法與FDNB法測定了熱處理酪蛋白/乳糖混合物中活性Lys含量;Rutherfurd(1997 a)用胍基反應(yīng)法和FDNB法對血粉、小麥粉、肉骨粉、豆粉、棉子粉活性Lys含量進行比較。兩者結(jié)果表明,胍基反應(yīng)法測出活性Lys含量等于或高于用FDNB法(見表2)。因此,Rutherfurd(1997a, b)、Moughan(1996)指出該方法在消化試驗中能更加精確地確定Lys消化率,因為在分析粗原料和食糜Lys時,沒有減去蛋白質(zhì)水解前所破壞的Lys。從表3可見,在血粉、豆粉、肉骨粉、干燥玉米、熱脫脂乳粉以及棉籽粕中,常規(guī)氨基酸分析法測定回腸真消化率明顯低于可消化Lys含量。
表2胍基反應(yīng)法和FDNB法測定蛋白質(zhì)原料活性賴氨酸含量的比較 飼料原料 | FDNB法 | 胍基反應(yīng)法 | 血粉 | 84.4 | 88.0 | 小麥粉 | 3.1 | 3.1 | 肉骨粉 | 30.4 | 34.6 | 豆粉 | 27.1 | 32.3 | 棉子粉 | 14.7 | 14.4 |
2.3 熒光計分析法(OPA法)
Goodno等 (1981)設(shè)計了一種熒光計分析法,用鄰苯二甲醛(OPA)來估價蛋白質(zhì)活性Lys。Vigo等(1992報道美拉德反應(yīng)前后,不同富含碳水化合物奶產(chǎn)品,其活性Lys含量可用OPA分光光度計法進行測定(表4),從FDNB法測得的數(shù)據(jù)可以看出,透析前活性Lys明顯低于透析后,無透析樣品損失了活性Lys,可能是由于糖含量較高。當(dāng)有糖存在時,F(xiàn)DNB法測量活性Lys會過低。從OPA法測得的結(jié)果來看,透析與不透析的差異不明顯。所以在有高水平糖存在時,用OPA法分析飼料或食物活性Lys應(yīng)該是可行的。
表3幾種飼料原料中“常規(guī)”回腸真消化賴氨酸與可消化“活性”賴氨酸的比較 飼料原料 | 賴氨酸消化率 | 標(biāo)準(zhǔn)誤 |
“常規(guī)”
| 可反應(yīng) | 血粉 | 96.3 | 96.7 | 0.41NS | 小麥 | 92.6 | 92.1 | 0.45NS | 肉骨粉 | 88.9 | 91.5 | 0.76NS | 豆粕 | 94.5 | 96.5 | 0.41※ | 干燥玉米 | 80.5 | 84.3 | 1.54※ | 熱脫脂乳粉 | 69.1 | 94.0 | 1.11※※※ | 棉籽粕 | 62.1 |
71.9
| 1.75※※ |
NS表示差異顯著;※, P<0.01; ※※, P<0.05; ※※※, P<0.001(Rutherfurd 等,1997)。
表4 相同模式下OPA法和FDNB法測出透析和未透析奶制品賴氨酸值
| 未透析樣品 |
| 透析樣品 | OPA | FDNB | OPA | FDNB | 樣品1 | 8.2±0.16 | 7.3±0.09 |
| 8.2±0.10 | 8.4±0.12 | 樣品2 | 7.0±0.21 | 6.5±0.15 |
| 7.1±0.15 | 7.1±0.08 | 樣品3 | 6.2±0.17 | 5.0±0.09 |
| 6.3±0.18 | 6. 1±0.05 | 樣品4 | 4.6±0.11 | 4.0±0.04 |
| 4.5±0.03 | 4.6±0.03 | 巴氏法滅菌牛奶 | 8.9±0.19 | 6.9±0. 04 |
| 8.8±0.19 | 8.5±0.16 | 牛奶粉 | 8.0±0.09 | 6.5±0.07 |
| 8.0±0.1 5 | 7.7±0.04 | 濃縮甜牛奶粉 | 7.4±0.12 | 6.4±0.13 |
| 7.3 ±0.18 | 7.1±0.05 |
※樣品1 未加熱, 樣品2 60°C加熱20小時, 樣品3 100°C加熱1小時, 樣品4 120°C加熱45分鐘; 表中數(shù)據(jù)為平均±標(biāo)準(zhǔn)差。
與其它化學(xué)方法比較,用OPA法估計奶產(chǎn)品活性Lys有以下幾個優(yōu)點:1)糖不會干涉;2)分析樣品量少;3)操作簡單;4)沒有嚴(yán)格的處理,如蛋白質(zhì)水解、加熱或溶劑萃取,可以在短時間內(nèi)完成。
2.4 化學(xué)計量染色法
Ibolya和Margit (1985)使用化學(xué)計量染色法確定大豆蛋白活性Lys含量,根據(jù)蛋白質(zhì)自由堿性基團與1-苯-2萘酚-6, 8二磺酸(OG)反應(yīng)來確定。蛋白質(zhì)游離的部分堿性基團(組氨酸、精氨酸和Lys)來確定總氮含量,部分堿性基團通過美拉德反應(yīng)來確定總氮變化。根據(jù)兩個分子結(jié)構(gòu)不同而作出的假設(shè),OG顏色敏感性只有AO-12(十二烷基二甲基氧化銨)的一半。因為OG含氮載體能夠結(jié)合兩個氨基,而AO-12只能結(jié)合一個氨基。染料與蛋白質(zhì)比通常小于1, AO-12測定活性Lys是直接根據(jù)它的染色能力。
染色法是測量蛋白質(zhì)熱反應(yīng)最方便的方法,具有便宜、省時省力、不需要水解蛋白質(zhì)等優(yōu)點。3 小結(jié)
FDNB法、胍基反應(yīng)法、熒光計分析法和化學(xué)計量染色法四種方法各有優(yōu)缺點。在實際生產(chǎn)中,為了檢測活性Lys的結(jié)果更加準(zhǔn)確,應(yīng)根據(jù)不同飼料原料選擇不同的方法。通過測定飼料和回腸食糜活性Lys含量,我們能夠精確估計飼料成本,更有效地選擇飼料原料,從而為配制高效日糧提供理論依據(jù),進一步改善日糧蛋白質(zhì)的利用效率,為節(jié)約蛋白質(zhì)資源開辟新的道路。
參考文獻(xiàn)
1 Swaisgood, HE and Catignani, GL. Digestibility of modified milk proteins: nutritional implications. J. Dairy Sci. 1985, 68, 2782-90.
2 Carpenter, KJ.. The estimation of the available lysine in animal protein foods. J. Biochem. 1960, 77, 604-10.
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