植酸酶活性測定應(yīng)注意的幾個(gè)問題

lilyyang · 發(fā)表于 2010-10-7 10:28:42

　　1 溫度
　　植酸酶作為一種酶制劑，對溫度非常敏感，溫度低會降低它的生物活性;溫度高也會降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在檢測過程中對溫度的控制則顯得非常重要，國標(biāo)要求植酸酶活性測定時(shí)的溫度為(37±0.1)℃。在33℃時(shí)植酸酶不能很好地發(fā)揮其活性，酶活與其真實(shí)值相比約低10%;在40℃時(shí)，部分植酸酶會失活，酶活與其真實(shí)值相比約低8%。另外，水浴加熱時(shí)，水浴液面要超過試管內(nèi)反應(yīng)液液面，使其在規(guī)定時(shí)間內(nèi)充分反應(yīng)。
　　2 pH值
　　pH值在酶活測定時(shí)影響很大，國標(biāo)要求pH值為5.5。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，植酸酶活力基本消失。盡量不要用酸度計(jì)來調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，因?yàn)樗岫扔?jì)存在一定的誤差，使用時(shí)間長了會發(fā)生鈍化，使測定的pH值不準(zhǔn)?？梢酝ㄟ^計(jì)算緩沖溶液中H+濃度的方法來配制一定pH值的溶液。如：①配制0.25mol/l乙酸緩沖液，加入34.02g三水乙酸鈉、2.78ml濃鹽酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH試紙測定溶液pH值為5.0。筆者曾用酸度計(jì)對照，配制上述pH值溶液需加入濃鹽酸6ml，1：3鹽酸約20ml，此溶液pH值實(shí)際上已經(jīng)低于5.0，由此說明此酸度計(jì)已經(jīng)反應(yīng)遲鈍。②配制0.25mol/l、pH值5.50的乙酸緩沖液，需加入34.02g三水乙酸鈉、1.24ml濃鹽酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH試紙測定溶液pH值為5.50。
　　3 底物植酸鈉的型號
　　植酸鈉有兩種型號，一種是Sigma p-3168，分子量為923.8;另一種是Sigma p-8810，分子量為660.03。根據(jù)國標(biāo)要求，植酸鈉應(yīng)為Sigma p-3168，筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Sigma p-3168植酸鈉底色淺，且作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)梯度較好(見表1、表2)。
　　由表1、表2可以看出檢測植酸酶活性時(shí)用Sigma p-3168為反應(yīng)底物較好。
　　4 離心速度和時(shí)間
　　當(dāng)水浴30min終止酶解反應(yīng)后，需要進(jìn)行離心。國標(biāo)要求4 000r/min，離心10min。若以3 000r/min離心10min，則離心不徹底，測吸光度時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度不呈梯度;以5 000r/min離心10min時(shí)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線各梯度的吸光度與以4 000r/min離心10min時(shí)相比偏低。如果應(yīng)用國標(biāo)改進(jìn)法，乙酸緩沖液中加入了牛血清白蛋白，離心時(shí)間需要15min。筆者曾用國標(biāo)改進(jìn)法進(jìn)行了時(shí)間對比實(shí)驗(yàn)，測定酶活時(shí)離心10min和15min后樣品的吸光度(見表3)。
　　由表3可見，離心時(shí)間對測定結(jié)果影響很大。
　　5 公式換算
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中即使做得再成功，若公式換算出錯(cuò)，將會前功盡棄。植酸酶絕對法測定酶活時(shí)，計(jì)算公式如下：
　　式中：C——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由曲線回歸方程計(jì)算出的y值(U);
　　F——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù);
　　m——試樣質(zhì)量(g);
　　30——反應(yīng)時(shí)間(min)。
　　其中F所代表的總稀釋倍數(shù)換算時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，現(xiàn)在我們舉例說明：稱取500IU植酸酶1.000 0g，用乙酸緩沖液溶解并稀釋定容至100ml，從其中取出1ml繼續(xù)稀釋至12.5ml，稀釋倍數(shù)為1 250;若稱取1 000IU植酸酶 0.500 0g，用上述方法進(jìn)行稀釋，則稀釋倍數(shù)為2 500，計(jì)算時(shí)若寫成則錯(cuò)誤，這樣就多乘了2倍。應(yīng)寫成，這是在公式換算時(shí)應(yīng)注意的問題。
　　(編輯：崔成德，cuicengde@tom.com)