海藻糖對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響研究

apple12151007

　　海藻糖（Trehalose）又名繭蜜糖、蘑菇糖、漏蘆糖或簟糖，是在動物、植物、微生物中廣泛分布的一種低聚糖，當生物處于逆境時，其含量增加，是一種典型的應激代謝產(chǎn)物。海藻糖由兩分子的吡喃葡萄糖單體以α－1，1－糖苷鍵連接而成，其化學名為α－D－吡喃葡萄糖基-α-D－吡喃葡萄糖苷，分子式為C12H12O11，相對分子量為378.33（含兩分子結晶水），熔點為97 ℃，加熱會失去結晶水。由于其分子結構對稱，無半縮醛基，所以既無還原性，也無變旋光性。海藻糖除了具有低聚糖的一般特性（低熱值、抗齲齒性、非消化性、有膳食纖維的作用、有利于雙歧桿菌的增殖）外，還有其獨特的物理化學特性，甜度為蔗糖的45％；耐熱耐酸，是二糖中最穩(wěn)定的。既使與氨基酸、蛋白質等混合加熱也不會發(fā)生美拉德反應，一般的酶不能將其水解。海藻糖具有很好的防腐性，對逆境具有高抗性，許多含海藻糖的動植物完全干燥后仍維持其活性，一旦遇水后，立即復活。海藻糖的生物保護機制一般認為是其生物保護機構能強力地束縛水分子，與脂膜質共同擁有結合水或海藻糖本身起到代替膜結合水的作用，從而防止蛋白膜的變性。由于其具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高溫、吸水、低甜度、保濕、生物保護等特點，使得他在食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品、農業(yè)等方面有很大的應用前景，已成為近年來研究的熱點。

　　植酸酶是一種能水解植酸的酶類,具有很多生理功能,飼料中添加植酸酶,可以提高磷的利用率,保護環(huán)境,植酸酶在畜禽養(yǎng)殖上的應用已基本得到肯定。目前植酸酶雖然廣泛應用,但在制粒過程中酶活的喪失或下降始終是制約它應用的一個問題,在制粒高溫(75~95 ℃)過程中,植酸酶的活性將會大幅降低。目前已對生物提取的植酸酶進行了包被,加入了一些化學物質,提高了其高溫條件下的穩(wěn)定性,其中海藻糖已經(jīng)被作為一種包被成分在商品植酸酶中使用,本試驗選用海藻糖和商品植酸酶為材料來研究海藻糖對商品植酸酶的耐高溫的影響。

　　1　材料與方法1.1　主要設備儀器恒溫水浴鍋：（37±0.1） ℃；分光光度計(有10 mm比色皿，可在415 nm下測定吸光度)；EMS－9A型磁力攪拌器；PHS－3C型酸度計（可精確至小數(shù)點后兩位）；電爐子、電子秤、移液管、移液槍(1、5 ml)、試管（5、10、20 ml）、燒杯（5、10 ml） 、量筒、溫度計（1~100 ℃）等。

　　1.2　主要試劑及配制方法商品用植酸酶(黃褐色小顆粒,活性為5 000 U/g);植酸鈉、海藻糖均購自北京拜爾迪生物技術有限公司。

　　乙酸緩沖液：稱取30 g三水合乙酸鈉和0.126 g無水氯化鈣，溶解在約500 ml蒸餾水中，用冰醋酸調節(jié)pH值至5.5，定容至1 000 ml，保存期1周。

　　植酸鈉溶液(7.5 mmol/l)：稱取0.693 g肌醇六磷酸鈉(Sigma公司生產(chǎn))于100 ml容量瓶中,用乙酸緩沖液溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　硝酸溶液：量取100 ml濃度為65%的濃硝酸與200 ml蒸餾水混合。

　　鉬酸銨試劑：稱取100 g鉬酸銨(天津市化學試劑四廠生產(chǎn)),溶解在800 ml蒸餾水，再加入10 ml 25%的氨水，定容至1 000 ml，儲存于暗處。

　　釩酸銨試劑：稱取0.235 g釩酸銨，溶解在70 ml水中，預熱至55 ℃，加入2 ml稀硝酸，定容至100 ml儲存于暗處。避光條件下保存1周有效。

　　顏色終止液：移取2份硝酸溶液、1份鉬酸銨溶液，1份釩酸銨溶液混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　基準物（磷酸二氫鉀，購自天津市北方天醫(yī)化學試劑廠），各種常用玻璃器皿（需不含磷）。

　　1.3　試驗設計1.3.1　酶樣試劑的準備精確稱取1 g植酸酶(精確到0.001 g)、1 g植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中,加入約70 ml pH值為5.5的乙酸緩沖液，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成懸浮液。將此懸浮液靜置0.5 h，直至上清液完全析出后取上清液待用。每個樣品做1個平行樣，逐級稀釋測定酶活性。
　　1.3.2　酶樣試劑的稀釋（逐步稀釋）酶液用醋酸緩沖液進行適當稀釋,控制吸光度 OD值在0.1～0.6,確保試驗結果準確度。

　　取上清液1 ml于1號試管中,加入醋酸緩沖液4 ml,搖勻;取1號液1 ml于2號試管中,加入醋酸緩沖液3 ml,搖勻;取2號液1 ml于試管中,加入醋酸緩沖液2 ml,搖勻。(待反應液)具體稀釋步驟如下（見表1）。

　　1.3.3　反應步驟每組取4支試管(樣品和樣品空白各設1個平行,取其平均值)分別加入1.8 ml醋酸緩沖液,再各加0.2 ml待反應液。搖勻，37 ℃預熱5 min。樣品中加4 ml底物，樣品空白中加4 ml終止液，搖勻。37 ℃水浴反應30 min（樣品空白可以不反應）后，樣品中加4 ml終止液，空白中加4 ml底物，搖勻，靜置后在415 nm下測定吸光度OD415。具體反應步驟見表2。

　　1.4酶活力測定

　　1.4.1　測定方法采用絕對法（仲裁法）。

　　1.4.2　酶活力單位定義酶活力單位定義：37 ℃，pH值為5.5條件下，每分鐘水解植酸鈉溶液釋放1 μmol無機磷的酶量為1個酶活單位。活性赿高，單位時間內水解植酸、植酸鹽的量就越多。


　　1.4.3　待測酶液的制備精確稱取兩份1 g的植酸酶(精確到0.001 g)、1 g的植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中，加入約70 ml pH值為5.5的乙酸緩沖液，在磁力攪拌器上高速攪拌30 min，制成懸浮液。

　　1.4.4　繪制標準曲線準確稱取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基準物磷酸二氫鉀于100 ml容量瓶中,用乙酸緩沖液溶解,并定容至100 ml,濃度為50.0 mmol/l,再按表3中的比例稀釋成不同濃度,按表2中的步驟與試樣一起反應并測定,以無機磷濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,列出直線回歸方程(y=ax+b)。標準曲線的數(shù)據(jù)見表3和圖1。

　　1.4.5酶活力計算

　　將反應完的溶液在室溫下靜置10 min達澄清后在分光光度計415 nm波長處測定樣品空白的吸光值和樣品溶液的吸光值。

　　其原理是利用植酸酶水解植酸鹽釋放無機磷，通過加入酸性鉬-釩試劑，使水解反應停止，同時與水解釋放出來的無機磷產(chǎn)生顏色反應，形成黃色的釩鉬磷絡合物，在波長415 nm下進行比色測定磷的含量。以標準磷溶液(或標準植酸酶)為參照，計算酶活力。

　　酶活力計算公式：U=F×C/30m式中：U——試樣中植酸酶的活性（U/g）；C——根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的磷濃度；F——試樣溶液反應前的總稀釋倍數(shù)；m——試樣質量（g）；30——反應時間（min）。

　　以相應不加熱的酶活力作對照(100％)，測定植酸酶活力保留率。

　　酶活力保留率(％)=(加熱后酶活/不加熱的原酶活性)×100%=(85 ℃后反應得到的OD415/不加熱原酶樣反應后得到的OD415)×100%以不加海藻糖的酶活力保留率為對比，比較海藻糖對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響。根據(jù)公式計算酶活力。

　　2 數(shù)據(jù)計算與結果分析
　　2.1 數(shù)據(jù)計算（見表4）C1=(0.170-0.035)/0.035=3.857，U1=6 000×3.857/30=771.4；C2=(0.058-0.035)/0.035=0.657，U2=6 000×0.657/30=131.4；C3=(0.103-0.035)/0.035=1.943，U3=6 000×1.943/30=388.6；C4=(0.112-0.035)/0.035=2.2，U4=6 000×2.2/30=440;C5=(0.126-0.035)/0.035=2.6，U5=6 000×2.6/30=520。

　　酶活保留率U'2=(U2/U1)×100%=(131.4/771.4)×100=17.1%；酶活保留率U'3=(U3/U1)×100%=(388.6/771.4)×100=53.4%；酶活保留率U'4=（U4/U1）×100%=（440/771.4）×100=57.1%；酶活保留率U'5=（U5/U1）×100%=（520/771.4）×100=67.4%。

　　2.2 結果分析

　　添加不同量的海藻糖對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響(見圖2)

　　從圖2可見，植酸酶溶液中加入等體積的海藻糖溶液,85 ℃處理5 min后均能提高在高溫下的熱穩(wěn)定性，加入40、60和80 mg海藻糖的植酸酶其酶活保留率分別達到了53.4%、57.1%和67.4%，較原酶活保留率17.1%分別提高了36.3、40、50.3個百分點。添加80 mg海藻糖對植酸酶的熱穩(wěn)定性提高效果最好。

　　3 討論

　　3.1 研究進展酶的穩(wěn)定性一直是困擾其大規(guī)模應用的主要原因。為了保持酶的活力，國內外大多采用在濃縮液中加入金屬離子、多元醇、多糖類化合物等方法。海藻糖作為一種多醇化合物，既可通過氫健與酶蛋白表面分子相連結，也能通過氫健有效地與外部水分子相連結，使酶蛋白分子穩(wěn)定。本試驗在植酸酶中加入不同質量的海藻糖均能提高商品植酸酶在高溫下的熱穩(wěn)定性，其中以80 mg海藻糖的效果最好。其在生產(chǎn)中的應用如何尚需作進一步的研究。

　　隨著基因工程與蛋白質工程技術的發(fā)展，定點突變、同序方法和定向進化技術將逐漸應用于酶的熱穩(wěn)定性研究。在分子水平上對植酸酶基因進行改造，使植酸酶本身就具有良好的熱穩(wěn)定性無疑是很有意義的。


　　3.2 影響試驗效果的其它因素

　　在試驗過程中由于試驗條件和試驗環(huán)境的限制，試驗結果受諸多因素的影響，其影響因素除了pH值、溫度、濕度、作用時間、抑制劑、激活劑、底物和產(chǎn)物濃度，以及植酸、植酸酶來源等外，還表現(xiàn)在以下幾個方面:① 植酸酶的活性會因放置時間的加長而使其活性降低，故其酶活力保留率也會隨之降低。② 試驗水浴溫度不太穩(wěn)定時有變化，從而使試驗結果出現(xiàn)偏差。

　　4 結論

　　本試驗采用絕對法對不同濃度的海藻糖對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響進行研究，結果表明添加80 mg海藻糖對植酸酶的熱穩(wěn)定性提高效果最好，酶活力保留率提高了50.3個百分點。在植酸酶液中加入海藻糖比不加時酶活力保留率提高36.3~50.3個百分點。

　?。▍⒖嘉墨I20篇，刊略，需者可函索）（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）李融，天津農學院動物科學系，300384，天津。

　　蘇琰(通訊作者)，揚州大學生物科學與技術學院。

asiazhang1980

回復 apple12151007 的帖子

學習了，受用。

hujinshui

我們是外噴植酸酶