[討論]分子生物學(xué)方面的資料

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胚胎干細胞培養(yǎng)標準化操作規(guī)程 6/28/01

目錄

一、細胞

二、一般培養(yǎng)-保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基
細胞復(fù)蘇
凍存細胞
明膠包被
細胞傳代

三、體外分化
培養(yǎng)基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法

四、移植細胞的準備

細胞

多能性胚胎干細胞產(chǎn)生于小鼠胚泡
1．表達綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細胞。由Dr. Nagy的實驗室制備。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時大約傳了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。我們得到時大約傳了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表達J1細胞，由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。
5．表達黃色熒光蛋白的YC5-ES細胞，由Dr. Nagy的實驗室提供。

一般培養(yǎng)--維持ES細胞處于未分化狀態(tài)
ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。


培養(yǎng)基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液
DMEM(高糖)
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

復(fù)蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復(fù)蘇是很重要的。

步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。

凍存細胞
凍存液
90％HS和10％二甲基亞砜

步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刮刀收集細胞；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過夜，第二天移入液氮。

明膠包被
準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。

細胞傳代
建議每2－3天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。

1．去除培養(yǎng)液；
2．1×無鈣鎂PBS洗滌；
3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀釋。)37℃孵育5分鐘。
4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；
5．將細胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min；
6．去除上清，將細胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。
如果加入培養(yǎng)基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。
7．將細胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內(nèi)將黏附，而ES細胞仍將保持懸?。?；
8．將含有細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入明膠包被（見下文）的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細胞有聚集成團的傾向）
9．建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)
保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。

體外分化
多能胚胎干細胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細胞通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并最終分化在第5步。細胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。
時間線（總時間為27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
培養(yǎng)基
EB
配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基--見前述）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml

ITSFn and N3：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml FALCON管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。
貯存液
DMEM(高糖)
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白100μg/ml
纖維連接蛋白250μg/ml
堿性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。

ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準備
使用無菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對溶液進行過濾，如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進行過濾，需要在管子上標明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細胞培養(yǎng)。
貯存液 溶劑，貯存液，稀釋劑和儲存
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白（100μg/ml）
纖維連接蛋白（250μg/ml ）
堿性rhFGF, （10μg/ml）

包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）

包被液的準備
多聚-L-鳥氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鳥氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結(jié)合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被過程：
1．加入多聚-L-鳥氨酸，至少2－3小時（過夜也行）
2．吸出多聚-L-鳥氨酸
3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時
4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干
5．貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時需要劇烈震蕩培養(yǎng)板。

體外分化方法

第1步：ES培養(yǎng)基
在LIF（ESGRO）存在的條件下維持細胞培養(yǎng)

第2步：EB培養(yǎng)基
使用細菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1．分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）
2．純化2小時后將細胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計數(shù)細胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
3．用2mlEB培養(yǎng)基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
4．一個15cm的細菌培養(yǎng)皿接種4～5×106個細胞（1個完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個同樣規(guī)格的細菌培養(yǎng)皿）。
5．2天后更換培養(yǎng)基
將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細菌培養(yǎng)皿中。
6．用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養(yǎng)皿之中放置1個細菌培養(yǎng)皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
形成胚狀體需要4天時間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。

第3步--ITSFn培養(yǎng)基
在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細胞
1．在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基
2．并非所有胚狀體在這一時期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
3．保持細胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
觀察細胞形態(tài)，神經(jīng)樣細胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細胞能夠被鑒別時，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細胞出現(xiàn)第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培養(yǎng)基＋bFGF
通過將神經(jīng)前體細胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進行擴增。
1.PBS洗滌，加入2ml 1×胰酶（1個15cm的培養(yǎng)皿所需胰酶的量根據(jù)前文表中的體積）（10×胰酶EDTA用PBS稀釋）
2．37℃孵育5分鐘
3．用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4．將細胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
5．將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更換培養(yǎng)基

第5步－N3培養(yǎng)基
通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細胞分化
1．細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基
2．根據(jù)需要換液（大約每隔一天）
3．分化10～15天后固定細胞
移除培養(yǎng)基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
室溫放置30分鐘
PBS洗滌2次
儲存于PBS。長期儲存使用含0.01％疊氮化納的PBS
移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過程中的第2步末細胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。

移植
1．將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。
細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中
3．離心3分鐘
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）
5．37℃水浴5分鐘
6．加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次
小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
7．離心2分鐘
8．吸出上清將細胞重懸于500μl EB培養(yǎng)基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．離心2次
11．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基

煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
1．準備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）
3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養(yǎng)基）
4．如前所述將細胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細胞懸液，
5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
6．離心2分鐘
7．吸出上清將細胞重懸于2ml EB培養(yǎng)基
8．重復(fù)一次
9．離心2分鐘
10．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基并置于冰上。

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上傳文件不能下載,我把全文打出來,彌補我的不足,請大家多多諒解


分子生物學(xué)技術(shù)綜合實驗講義


上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院
2004年11月
說 明

本實驗講義是在接受了去年實驗的成功經(jīng)驗和失敗的教訓(xùn)的基礎(chǔ)上編寫的。實驗的名字叫“分子生物學(xué)技術(shù)綜合實驗”，原來是想把它設(shè)計成一個彼此連貫、前后呼應(yīng)的系列實驗。但由于經(jīng)費和條件的限制，還是放棄了這個念頭。
實驗分成兩個部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亞克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝膠電泳和免疫雜交。兩個部分的分量大致相當(dāng)，但后一部分做起來對學(xué)生的收獲可能更大些，因為很少有本科生能一個人原原本本地親手做一做免疫印跡實驗的。它的操作雖然并不復(fù)雜，但成本卻很高，特別如果使用的是從公司購買的抗體的話。
實驗講義在文字上，主要參考了魏群主編的《分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)》，而在實質(zhì)內(nèi)容上，DNA操作部分更多的是參考了薩姆布魯克等人的《基因克隆》第二版的中譯本，蛋白質(zhì)部分主要是根據(jù)自己平日工作的積累。
希望同學(xué)們能夠珍惜這次機會，認真地做實驗，真正地掌握些實實在在的實驗操作技能，為今后的學(xué)習(xí)和工作打下基礎(chǔ)。千萬不要忽視實驗技能的培養(yǎng)和提高，生物學(xué)的成就畢竟主要是通過實驗干出來的。

上海交大生命學(xué)院 孫群
2004年11月

實驗一 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

[實驗原理]（供參考，試劑盒的Solution SS成分未知）
細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。其原理是：在0℃下的CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化緩沖液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羥基—鈣磷酸復(fù)合物，此復(fù)合物粘附于細菌細胞表面。42℃短時間熱處理（熱休克），可以促進細胞吸收DNA復(fù)合物。將處理后的細菌放置在非選擇性培養(yǎng)液中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Amp抗性) 得到表達。然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37℃培養(yǎng)過夜，這樣即可得到轉(zhuǎn)化菌落。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．小型高速離心機
2．恒溫搖床
3．恒溫箱
4．-20℃冰箱
5．恒溫水浴器
(二)材料
1．氨芐青霉素
2．大腸桿菌DH5a
3．pUC19
4．1.5mL 離心管
5．槍頭、槍
6．試管、培養(yǎng)皿
(三)試劑
1．快速感受態(tài)細菌制備試劑盒（申能博彩公司產(chǎn)品）
2．LB培養(yǎng)液
在950mL去離子水中加入：
胰蛋白胨 (tryptone) 10g
酵母提取物 (yeast extract) 5g
NaCl 10g
搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用Na0H調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1L，121℃濕熱滅菌20min。
3．氨芐青霉素(Amp)，用無菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。

[實驗步驟]
1．從大腸桿菌DH5a平板上挑取一個單菌落接于2mL LB培養(yǎng)液的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2．取50mL菌液轉(zhuǎn)接到一個含有5mL LB培養(yǎng)液錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時。
以下步驟按修改后的試劑盒說明書進行。
3．用滅菌的槍頭取0.5mL的大腸桿菌培養(yǎng)物于1.5mL滅菌離心管中，冰上放置3分鐘后，加入0.5mL預(yù)冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 槍頭將細胞懸浮起來。注意：1mL的取液器設(shè)定在500mL。懸浮細胞要輕，防止細胞進入槍內(nèi)。
4．將上述細胞分裝于1.5mL離心管 (離心管要在放在冰上預(yù)冷) 中，每管0.1mL。細胞可以立即使用或儲存。
5．將感受態(tài)細胞迅速轉(zhuǎn)移到-20℃或更低的低溫冰中。注意：在轉(zhuǎn)移過程中要防止溫度升高，解決的辦法之一是在塑料袋里裝上低溫冰塊，將細胞迅速轉(zhuǎn)移到塑料里，將整個塑料袋放到低溫冰箱內(nèi)。

轉(zhuǎn)化：
1．新鮮制備的或-20℃下保存的100mL感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解冰后輕輕地將細胞均勻懸浮。
2．加入5mL pUC19質(zhì)粒，DNA濃度為10pg/mL，輕輕混勻。
3．冰上放置30分鐘。
4．42℃水浴熱激60秒。
5．冰上放置2分鐘。
6．加400mL LB培養(yǎng)液，37℃ 250轉(zhuǎn)／分振蕩培養(yǎng)30分鐘。
7．室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400mL上清液，用剩余的培養(yǎng)液將細胞懸浮。
8．將細菌涂布在 Amp/LB瓊脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小時，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，培養(yǎng)過夜。

[實驗結(jié)果]
經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜的、在氨芐青霉素/LB瓊脂平板上出現(xiàn)的菌落即為pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。計數(shù)菌落總數(shù)，計算制備的感受態(tài)菌的轉(zhuǎn)化效率，以每mg 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)表示。
實驗二 質(zhì)粒DNA的提取

[實驗原理]
堿裂解法提取質(zhì)粒利用的是共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓撲學(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線狀的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低后，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈迅速而準確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，不能迅速而準確地復(fù)性，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA卻留在上清液中。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．恒溫培養(yǎng)箱
2．恒溫搖床
3．小型高速離心機
4．高壓滅菌鍋
(二)材料
1．帶有pQE-31質(zhì)粒和pUC18-CAT質(zhì)粒的兩株大腸桿菌
2．1.5mL 離心管
3．槍頭、槍
(三)試劑
質(zhì)粒小量制備試劑盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

試劑盒的參考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸鈉)，用前等體積混合
Solution III
5mo1／L 醋酸鉀 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE緩沖液
10mmo1／L Tris·HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
將RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。

[實驗步驟]
(一)提取質(zhì)粒
將3mL含Apm的LB液體培養(yǎng)基加入到兩支試管中，分別接入含pQE-31質(zhì)粒和pUC18-CAT的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
以下的操作按試劑盒的說明書進行。(附試劑盒說明書)
(二)質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳
將5mL洗脫液與3mL的DNA樣品緩沖液混合，加于1.2% Agarose 做凝膠電泳分析。



附：試劑盒說明書

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1
上海申能博彩生物科技有限公司
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試劑盒組成：

組成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次）
Solution I(a) 5m1 10m1 25m1
Solution II(b) 10m1 20m1 50ml
Solution lll 20m1 50m1 2x50m1
Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1
TE(d) 5m1 10m1 40m1
3S Column 50支 100支 250支
Co11ection tube 50支 100支 250根
說明書 1份 1份 l份

注：
a)Solution I內(nèi)含RNaseA，每次實驗結(jié)束后，4℃保存。
b)溫度低時，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保溫溶解，搖勻后使用。
c)首次使用前，必須在Wash Solution 瓶中加入50ml無水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后將瓶蓋旋緊，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脫，但是用水洗脫DNA，效率通常要低—些。抽提測序用質(zhì)粒需要用水洗脫。
主要特點：
● 采用改良的堿裂解方法，質(zhì)量穩(wěn)定，重復(fù)性好。
● 經(jīng)濟快速，每個抽提可以在20分鐘內(nèi)完成。
● 無需酚抽提，無需乙醇沉淀，無需CsCl離心。
● 質(zhì)粒純度高，洗脫體積小，適合于DNA全白動熒光測序。

實驗操作步驟(從細菌中抽提質(zhì)粒)

1．將過夜培養(yǎng)的2m1細菌，測序用質(zhì)粒抽提請用5m1細胞，高速離心1分鐘，徹底去除上清。
2．加入100ml solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。
注意：對于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，請用5m1細胞；
質(zhì)粒如果用于全自動熒光測序分析，請用5ml細胞，無需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下顛倒或用手指彈管底，使細菌裂解，室溫放置(2分鐘左右)至溶液變成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜顛倒5—10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。
注意：步驟2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速離心，15，000轉(zhuǎn)／分鐘，10分鐘。無需低溫離心。
注意：提高離心速度，使沉淀更加緊密，步驟6操作取上清更為方便。
6．取出2m1樣品收集管和3S柱，在管壁標上樣品號，將步驟5中的上清全部轉(zhuǎn)移到(吸或倒入)3S柱里。蓋上離心管蓋子(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔(dān)心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，室溫放置2分鐘 (室溫放置時間不重要，可長可短)；用臺式離心機室溫高速(12，000轉(zhuǎn)／分鐘)離心1分鐘。
注意：轉(zhuǎn)移上清時不要吸取沉淀，否則會出現(xiàn)Genomic DNA和蛋白質(zhì)污染。
離心管蓋子蓋上時，柱子內(nèi)壓的增加，可能會使部分溶液從柱子底部流出，為正?，F(xiàn)象。
7．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，離心1分鐘。
8．重復(fù)步驟7一次。
9．取下3S柱，棄去掉收集管中的廢液，將3S柱放入同—支收集管中，高速離心2分鐘。
10．將3S柱放入干凈的1．5m1的離心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要蓋上離心管蓋, 室溫下放置2分鐘；蓋上離心管蓋，室溫高速離心1分鐘。
注意：將TE或水預(yù)熱到50℃左右可以提高洗脫效率。測序用質(zhì)粒用30ml預(yù)熱的水洗脫，濃度一般滿足測序要求。
11．洗脫的質(zhì)?？梢粤⒓从糜诟鞣N分子生物學(xué)操作或-20℃保存?zhèn)溆谩ml過夜培養(yǎng)細胞，質(zhì)粒如果用50ml水洗脫，通常情況下可以取10ml洗脫液做Agarose電泳或酶切分析。


實驗三 DNA的瓊脂糖凝膠電泳

[實驗原理]
DNA分子在高于等電點的pH 溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量堿基的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型，具有不同分子量的DNA片段遷移速度不一樣， 遷移速度與DNA分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同、但構(gòu)型不同的DNA分子。一般提取的質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)，開環(huán)DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂，(open circular DNA，簡稱ocDNA)，線狀質(zhì)粒DNA， 即質(zhì)粒DNA 在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂(linear DNA，簡稱LDNA)。由于這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同，因此通常抽提的質(zhì)粒在電泳后往往出現(xiàn)3條帶，其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．恒溫培養(yǎng)箱
2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
3．小型高速離心機
4．高壓滅菌鍋
5．紫外核酸檢測儀
(二)材料
1．pQE-31和pUC18-CAT質(zhì)粒
(三)試劑
1．50xTAE(50倍體積的TAE貯存液)
配1000mL 50xTAE：
Tris 242 g
冰醋酸 57 mL
0.5mol／L EDTA 200 mL
pH 8.0
2．凝膠加樣緩沖液(6x)
溴酚藍 0.25％
蔗糖 40％
3．瓊脂糖
4．溴化乙錠溶液(EB) 0.5µg／mL
5．250bp DNA 分子量標準

[實驗步驟]
(一)制備瓊脂糖凝膠
根據(jù)被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚?br>
瓊脂糖凝膠濃度％ 線性DNA的有效分離范圍／kb
0.3 5—60
0.6 1—20
O.7 0.8—10
O.9 0.5—7
1.2 0.4—6
1.5 0.2—4
2.0 0.1—3

實驗用1.2％瓊脂糖。稱取1.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL 1xTAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻即可。
(二)膠板的制備
1．取干凈的有機玻璃內(nèi)槽，用透明膠帶將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好(一定封嚴，不能留縫隙)。
2．將有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。
3．將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。
4．待膠凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明膠帶，然后將有機玻璃內(nèi)槽放在電泳槽內(nèi)。注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負電極一端。
5．加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米。
(三)加樣
用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔(記錄點樣順序及點樣量)。
(四)電泳
1．接通電泳槽與電泳儀的電源。DNA的遷移速度與電場強度成正比，一般電場強度不要超過5V／cm。
2．當(dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1—2cm處，停止電泳。
(五)染色
將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液(在200mL1xTAE緩沖液中加兩滴2mg/mL的溴化乙錠儲存液即可)，在脫色搖床上緩慢搖動下染色20-30分鐘。注意：溴化乙錠為致癌物，須戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染環(huán)境。

[實驗結(jié)果]
在紫外燈(360nm或254nm)下觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶(在紫外燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡，以防紫外線對眼睛的傷害作用)。

實驗四 DNA重組

[實驗原理]
DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
如果是單酶切，為了防止載體本身的自身連接，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，去掉酶切后5'端的磷酸。這樣做能有效防止質(zhì)粒的自身環(huán)化，降低轉(zhuǎn)化的背景，大大提高重組子的篩出效率。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16℃，反應(yīng)12-16小時(過夜)，這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細胞后，還須對轉(zhuǎn)化菌落進行篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．恒溫搖床
2．恒溫水浴
3．恒溫培養(yǎng)箱
4．小型高速離心機
(二)材料
1． 氨芐青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA連接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 質(zhì)粒
6． 培養(yǎng)皿
7． 接種針
8． 金屬涂棒
9． 1.5mL 離心管
10．酒精燈
11．鑷子、滅菌牙簽等
(三)試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）

[實驗步驟]
(一)質(zhì)粒DNA
用實驗二提取的pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒。
(二)制備重組DNA
1．在滅菌的1.5mL 離心管中，加入pQE-31質(zhì)粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切緩沖液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10個單位），無菌雙蒸水7mL，至反應(yīng)混合物總體積為20mL，離心混勻，37℃反應(yīng)過夜。
2．在另一無菌1.5mL 離心管中，加pUC18-CAT 質(zhì)粒20mL，加入3mL酶切反應(yīng)液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，無菌雙蒸水補到30mL，37℃反應(yīng)過夜。
3．反應(yīng)完畢后取5mL pQE-31質(zhì)粒的酶切液做電泳分析，檢驗酶切是否完全。酶切完全，進行下一步。
4．將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質(zhì)粒，分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳（注意加DNA分子量標準）。電泳結(jié)束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說明書的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb，后者為650bp。
5．將回收的pQE-31載體質(zhì)粒均分為兩份，其中一份與酶切后回收的CAT片段混合，做連接；另一份不加CAT片段，做對照。操作如下：
在10mL DNA樣品中, 加T4 DNA連接酶緩沖液1mL，T4 DNA連接酶1mL，14℃（室溫）過夜，然后做大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
(三)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
1．用實驗一制備的感受態(tài)細胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后處于冰浴的感受態(tài)細胞中，加入10mL連接產(chǎn)物，混勻，冰上放置30分鐘，以后的操作參照實驗一進行。同時做未加CAT片段的空白pQE-31載體質(zhì)粒連接處理后的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化的對照。

[實驗結(jié)果]
過夜培養(yǎng)后，實驗組和對照組的兩個培養(yǎng)皿上都可能會出現(xiàn)一些菌落。如果實驗組的菌落數(shù)明顯多于對照組的菌落，則是好征兆，但實驗組中出現(xiàn)的菌落是否含有所需的DNA重組子還須進一步鑒定。

附：試劑盒說明書

3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit
上海申能博彩生物科技有限公司
WWW．biocolor.com
試劑盒組成：

試劑盒組成 K131(50次) K132(100次) K133(250次)
3S Co1umn Collection Tube Solution SN Solution B Wash Solution(a) TE 說明書 50支 50支 30m1 10m1 22m1 10m1 1份 100支 100支 60m1 10m1 2X 22m1 10m1 1份 250支 250支 150m1 25m1 5X 22m1 10m1 1份
注：
(a)首次使用前，必須在Wash Solution 瓶中加入50ml無水乙醇，充分混勻后使用。每次
使用后將瓶蓋蓋緊，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。
(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脫，測序樣品請用水洗脫。
試劑盒DNA回收率：
3S柱對100bp以上的DNA片段有較好的結(jié)合性能和回收率，回收率在60％以上。

主要用途：
(a)TBE或TAE Agarose膠中回收DNA片段。
(b)從溶液中回收和濃縮DNA，去除反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)。

操作步驟
從Agarose膠中回收DNA：
1．用Agarose膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀割下要回收DNA的瓊脂塊，放入1．5m1離心管中。判定DNA片段的位置時，要盡可能使用長波長UV，在UV下照射的時間應(yīng)盡可能短。
2．按每100mg Agarose膠加入400ml Solution SN，置于55-65℃水浴中5分鐘，中途混勻，至膠完全融化。膠融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B，混勻。注意；高濃度的膠(1．5-2％)，每100mg膠加入500ml Solution SN，加熱融膠的時間延長到15分鐘，以保證膠全部融化，膠融化后加入100ml SolutionB，混勻。
3．將3S柱放入2m1收集管中，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到3S柱中，讓蓋子開著，室溫放置2分鐘。蓋上離心管蓋(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔(dān)心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，室溫離心(10，000rpm)1分鐘。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，加入600ml Wash Solution，室溫離心(10，000rpm)1分鐘。
5．重復(fù)步驟4一次。
6．取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，室溫高速離心(10000 rpm)2分鐘。
7．將3S柱放入一根新的1．5m1離心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室溫放置2分鐘。注意：提高洗脫溫度有利于提高DNA的洗脫效率。也可以用預(yù)熱的TE或水洗脫。
8．蓋上離心管蓋(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔(dān)心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，10，000rpm高速離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>
從溶液中回收和濃縮DNA：
1．根據(jù)溶液的體積和所要回收DNA的含量，加入5倍體積的Solution SN。如果溶液的體積不足100ml，加TE補足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混勻；
2．以下同從Agarose膠中回收DNA的步驟3-8。

實驗五 轉(zhuǎn)化后細菌菌落的快速裂解及質(zhì)粒大小的檢查

一般情況下，可以根據(jù)質(zhì)粒的大小來確定它是否帶有插入片段。以下方法足以產(chǎn)生在瓊脂糖凝膠的單個泳道上加樣所需的DNA量。操作方法如下：

1. 使轉(zhuǎn)化得到的細菌在含有氨卞青霉素的瓊脂培養(yǎng)基(LB)上生長至菌落直徑達1mm左右。
2. 用滅菌的牙簽挑取單菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB瓊脂平板上劃線。至少挑選20個左右的菌落照此劃線，平板于37℃培養(yǎng)過夜，然后保存于4℃，直到相應(yīng)菌落的回收。
3. 在劃線培養(yǎng)的同時，將每一菌落的剩余部分用牙簽一一轉(zhuǎn)移并洗脫到事先加有50mL 滅菌的10mmo1／L EDTA(pH8.0)的1.5mL離心管中。
4. 每管加50mL配制的0.2mo1／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振蕩30秒。
5. 于70℃溫育5分鐘，然后冷卻到室溫。
6. 加3mL 2mol／L KCl、0.2％溴酚藍的溶液，振蕩30秒。
7. 冰浴5分鐘。
8. 用微量離心機于4℃以12000g離心3分鐘，使細菌碎片的沉淀。
9. 制備1％的瓊脂糖凝膠(5mm厚)，將50mL上清液加入樣品槽內(nèi)(5×2.5mm，長×寬)。
10. 染料遷移到凝膠全長的2／3—3／4時，于室溫將凝膠放入溴化乙錠溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分鐘。
11. 紫外燈下觀察、拍照。


通過與同時點樣的載體質(zhì)粒的比較，不難發(fā)現(xiàn)重組子：比載體質(zhì)粒遷移慢的很可能是含有插入片段的重組DNA?？蓮谋４嬗?℃的重新劃線的平板上挑出相應(yīng)的菌落，接種于2mL含抗菌素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒，用做重組時相同的限制酶做酶切鑒定。重組子應(yīng)該可以切下預(yù)期大小的插入片段。

實驗六 GFP在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達和細菌蛋白的超聲破碎抽提

[實驗原理]
把含有外源基因的表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在有相應(yīng)抗菌素和誘導(dǎo)物的條件下培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)外源蛋白在大腸桿菌中表達。利用溶菌酶、反復(fù)凍融或超聲波破碎的方法將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細菌的細胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白釋放出來，再利用硫酸銨沉淀、蛋白質(zhì)層析技術(shù)和制備電泳等方法能夠?qū)⑼庠吹鞍追蛛x純化出來，供進一步的研究使用。有些過量表達的外源蛋白往往在細菌中形成不溶性的包涵體，細胞破碎、離心后這些包涵體出現(xiàn)在沉淀中，這樣的蛋白需要用高濃度的尿素或SDS變性處理后才能溶解。超聲破碎時要產(chǎn)生大量的熱，會引起蛋白的變性。為了避免產(chǎn)生高溫，超聲時一般使用間隔的脈沖處理，而且應(yīng)在冰浴中進行。本實驗使用超聲波破碎法抽提蛋白，因為表達的外源蛋白GFP（綠色熒光蛋白）比較耐高溫，故省去了冰浴。

[儀器、試劑和材料]
1、pGLO轉(zhuǎn)化的大腸桿菌
2、LB培養(yǎng)液
3、氨卞青霉素
4、L-阿拉伯糖
5、硫酸銨
6、細菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0)
7、恒溫搖床
8、小型高速離心機
9、超聲波組織細胞破碎儀
10、玻璃試管，三角瓶
11、1.5mL和5mL 塑料離心管
12、“槍”，槍頭

[實驗操作]
1、 大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)：
從Amp+/LB瓊脂板上培養(yǎng)的pGLO轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中挑取2-3個菌落，接種于Amp+（終濃度為50微克/mL）的5mL LB的玻璃試管中，培養(yǎng)兩管，放恒溫搖床中，37℃培養(yǎng)過夜。將其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培養(yǎng)物加到裝有150mL的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（終濃度為50微克/mL），恒溫搖床上37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2、 超聲破碎抽提：
將誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到數(shù)只5mL離心管中，8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，傾去上清液后，在沉淀上面再加培養(yǎng)物，繼續(xù)離心，將所有的培養(yǎng)物都收集在一起。每管中加入1.5mL的細菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用槍吹打，使沉淀懸浮。將離心管放在小試管架上，將超聲波破碎儀的金屬頭插到離心管中，調(diào)整好試管的位置后關(guān)上超聲破碎儀的門，打開儀器的電源，對每只離心管中的菌體進行超聲破碎。條件：功率80瓦，工作2秒，間隔2秒，每一次處理5個循環(huán)。
4次處理后，8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。取出離心管，在紫光燈下觀察離心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然為綠色，則說明破碎不夠，繼續(xù)按前面方法再超聲處理2次，然后再離心。如果僅有很少的綠色沉淀或根本看不到，說明破碎完全。
小心吸出上清液，集中放到干凈的5mL離心管中，體積不要超過4mL，逐步地加入少量硫酸銨干粉，使達到飽和，8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。將離心管取出，放紫光燈下觀察，沉淀中應(yīng)該能看到明亮的綠色熒光。將上清液傾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷凍于-20℃。

實驗七 免疫雙擴散檢測抗GFP血清抗體

[實驗原理]
在溶液中的可溶性多價抗原與血清抗體相遇，當(dāng)兩者的比例適當(dāng)時可以形成一種網(wǎng)狀的不溶性的大分子復(fù)合物，這叫作免疫沉淀反應(yīng)。當(dāng)這樣的抗原和相應(yīng)的抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相對擴散時，在抗原與抗體的比例適當(dāng)處會形成可見的沉淀線，這叫免疫雙擴散實驗，是免疫沉淀反應(yīng)的一種。免疫雙擴散常用于動物免疫效果的檢測和血清抗體效價的測定。本實驗使用的粗抗原是大腸桿菌表達的GFP的抽提物，抗體是GFP免疫兔子后得到的抗血清。

[儀器、試劑和材料]
1、磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7.4
2、1.5%瓊脂，PBS配置
3、兔抗GFP血清
4、GFP粗提物
5、微波爐
6、恒溫培養(yǎng)箱
7、載玻片
8、自制打孔器
9、小塑料盒
10、針頭、牙簽
11、“槍”、“槍頭”

[實驗操作]
1、1.5%瓊脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克瓊脂，微波爐中小功率加熱，使瓊脂完全溶化。
2、取干凈的載玻片，平放于實驗臺（臺面要水平），將融化的瓊脂趁熱加在載玻片上（約加4mL），使瓊脂鋪滿整個玻片的表面（注意勿使瓊脂流出玻片之外）。令其在室溫下冷卻凝固。
3、將載玻片放在畫好的打孔式樣的樣板上，用自制打孔器（內(nèi)徑2-3毫米）在瓊脂上照樣板打孔，做兩朵“花”。用針頭小心地將打好的孔中的瓊脂挑出，當(dāng)心不要碰傷了孔周圍的瓊脂。打好孔后，把凝膠的右下角切掉一小塊，作為標記。
4、GFP抗原的稀釋：用上次實驗得到的GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀，加100mL的PBS使溶解，此為抗原的原液。取出原液15mL，在一小塊封口膜上用PBS做系列的倍比稀釋，直到稀釋為1：16。
5、在左邊一朵花的中央孔中加約15mL的免疫后兔血清，周圍孔加不同稀釋度的GFP粗提物。右邊的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的與左邊的相同。加樣時將每孔加滿即可，注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中鋪一塊濾紙，加少量水將濾紙浸濕，上面放兩根牙簽，將加好樣的載玻片放在牙簽上，蓋好盒蓋，放37℃溫箱中過夜。

[實驗結(jié)果的觀察]
將載玻片從塑料盒中取出，在散射光的背景下（載玻片后方約15厘米處用手或深色物擋?。┯^察，或在特殊的裝置上觀察，在左側(cè)的抗體孔與適當(dāng)稀釋的抗原孔之間可見白色的沉淀線，而右側(cè)的對照則無。如果將載玻片放在紫光燈下觀察，沉淀線會發(fā)出綠色熒光，這說明抗原-抗體復(fù)合物中含有GFP。

實驗八 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測外源蛋白的表達

[實驗原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最經(jīng)常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內(nèi)部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結(jié)合而帶負電荷，電泳時在電場作用下，肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時受到的阻力不同，在遷移過程中逐漸分開，其相對遷移率與分子量的對數(shù)間成線形關(guān)系。
pGLO是將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖啟動子之后的一種表達載體。攜帶有pGLO的大腸桿菌在含有相應(yīng)誘導(dǎo)物和抗菌素的條件下培養(yǎng)，可以表達GFP，這比不加誘導(dǎo)物的同樣的大腸桿菌在SDS—PAGE凝膠上要多出一條明顯的條帶。表達的蛋白也可用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，紫光燈下可以看到誘導(dǎo)后的樣品在凝膠上有綠色熒光條帶出現(xiàn)。還可以通過免疫印跡染色（Western—blotting）的方法，用GFP的抗體檢測表達的外源蛋白。

[儀器、材料和試劑]
(一)儀器
1．垂直板電泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．電泳儀
3．干式恒溫培養(yǎng)器
4．微波爐

(二)材料
1． pGLO表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)物：用阿拉伯糖誘導(dǎo)的和沒有加阿拉伯糖誘導(dǎo)的

(三)試劑
1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 (已加SDS )
2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 (已加SDS)
3．10％SDS
4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放。
5．10％Ap (-20℃存放)
6．2x樣品緩沖液
0.5mo1／L Tris·HCl pH6.8 2mL
甘油 2mL
20％SDS 2mL
0.1％溴酚藍 0.5mL
2—b—巰基乙醇 l.0mL
雙蒸水 2.5mL
7．5x電極緩沖液
Tris 7.5g
G1y 36 g
SDS 2.5g
雙蒸水溶解，定容至500mL，使用時稀釋5倍使用
8．染色液：0.2g考馬斯亮藍R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，過濾備用。
9．脫色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85


[實驗步驟]
1．裝配做膠用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的膠。選擇兩側(cè)的玻璃夾條為1mm的玻璃板，將其夾條面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅膠夾條在上面擺好，然后把帶兩個“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅膠夾條平整、服帖地夾在兩塊玻璃板之間。小心地把這玻璃板“三明治”放到“提籃架子”上，用塑料的“楔子”夾緊，注意底部的U形硅膠夾條在夾緊的過程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夾縫加滿蒸餾水，檢驗是否漏，如果漏水必須重裝。
2．配制濃度為12％的分離膠 (凝膠濃度應(yīng)根據(jù)被分離蛋白的分子量進行選擇)，配方如下：

雙蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
10％ SDS 100 µL
TEMED 10 µL
10％AP 100 µL
總體積 10 mL （剛好灌制兩塊膠）

混勻后加入兩玻璃夾縫中，并小心在膠面上加入1cm蒸餾水(在膠面上加蒸餾水稱水封，目的是保持膠面平整，并防止膠與空氣接觸，影響膠的聚合)，室溫放置，等膠自然凝聚后（此時在膠面與水封之間可見清晰的界限），將水封傾去。這時可以開始配制4％的濃縮膠，配方如下：
雙蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
10％ SDS 30 µL
TEMED 5µL
10％Ap 30µL
總體積 3.0 mL （夠做兩塊板的濃縮膠）

混勻后加入到"三明治"玻璃板的夾縫中，然后在把1mm的梳子插進濃縮膠中，注意在梳子和濃縮膠之間不要留有氣泡。如果發(fā)現(xiàn)有較大的氣泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指彈氣泡處的玻璃等），否則會影響電泳結(jié)果。待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。如果發(fā)現(xiàn)拔出梳子后形成的加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，用注射器的針頭小心加以整理，使之齊整。
3．細菌培養(yǎng)物SDS-PAGE樣品的制作：同時做L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的和未加L-阿拉伯糖的兩個大腸桿菌樣。取細菌培養(yǎng)物1.5mL加到1.5mL小離心管中，12000r/m離心3分鐘，去上清。在離心沉淀中加約等體積的蒸餾水，用槍頭小心地吹打，使細菌充分懸浮，直到?jīng)]有明顯的小團塊，然后加入等體積的2×樣品緩沖液，在100℃沸水浴(或干式培養(yǎng)器)中保溫5min。此時如用槍頭吸取樣品，會發(fā)現(xiàn)非常粘稠，呈鼻涕狀，這是因為有樣品中含有大量DNA的結(jié)果。要用胰島素注射器將樣品從極細的針頭中打出，反復(fù)多次才能將DNA分子打斷，使樣品變得不再粘稠為止。將樣品14000r/m離心5分鐘，使不溶物沉淀下來，小心吸取上清加樣。電泳樣品的處理直接關(guān)系到電泳結(jié)果的好壞，一定要認真做樣，否則跑不出好膠來。
4．瓊脂封底：做好膠后，把玻璃板“三明治”從架子中取出，將兩玻璃板之間的硅膠夾條去掉。去掉夾條后在凝膠的底部會留下一空隙，此空隙要用2%融化的瓊脂填滿，否則在玻璃板浸到電極緩沖液后空隙中的空氣將很難徹底排除掉，電泳時會明顯影響導(dǎo)電，嚴重時會使整個電泳失敗。瓊脂封底時注意不要產(chǎn)生氣泡。
5．電泳槽組裝：封底后將玻璃板“三明治”凹玻璃面向內(nèi)重新裝到“提籃架子”上，固定好后，將整個部件放到電泳槽的外殼中，然后加電極緩沖液。加液時要使內(nèi)外槽中的液面基本等高，內(nèi)槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保證能夠?qū)щ姡译妶鼍鶆颉?br> 6．加樣：按事先設(shè)計好的順序與加樣量依次加樣。在樣品的濃度未知的情況下，同一樣品可加一梯度，即每一泳道的加樣量依次減半。這樣，在做第二次電泳時可以其作為參考，正確加樣。蛋白分子量標準可以加在靠中間的加樣孔中，也可加在離邊的第2道處（最靠邊的一道樣品往往會明顯跑斜）。
7．電泳：將電泳槽的蓋子蓋上，把電泳槽的兩個電極接到電泳儀上（注意電極不要接錯），然后接通電源。先將電壓調(diào)到80V，當(dāng)樣品進入分離膠時，調(diào)節(jié)電壓使恒定在150V。當(dāng)溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，關(guān)掉電源，停止電泳。將玻璃板從電泳槽中取出，小心地用舊的電話卡撬開兩玻璃板，暴露出膠面。將濃縮膠部分去掉不要，分離膠放到塑料盒中染色。
8．染色和脫色：凝膠在考馬斯亮藍染色液中染色20分鐘（搖床上緩慢振蕩），然后傾去染色液（染色液回收，可反復(fù)用數(shù)十次），用自來水洗幾下，去掉凝膠上和塑料盒中的染色殘液，加脫色液脫色（搖床上緩慢振蕩），1小時后換一次脫色液，振蕩脫色過夜。徹底脫色后的凝膠蛋白條帶清晰，背景透明干凈。這時可以將凝膠拍照或用掃描儀進行掃描，作為永久記錄。

[實驗結(jié)果]
染色后的聚丙烯酰胺凝膠上可見許多大大小小的條帶。比較兩個大腸桿菌樣品，經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)的與未加阿拉伯糖誘導(dǎo)的，前者在約25kD處明顯多一條帶，這就是GFP所在的位置。

實驗九 GFP的免疫印跡

[實驗原理]
免疫印跡（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分。第三步是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第一抗體染色后，再用酶標的第二抗體（堿性磷酸酶（Ap）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗第一抗體的抗體）染色，再加酶的底物顯色，通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。
為了使初學(xué)者能夠在實驗過程中觀察到所要檢測的目的蛋白，本實驗使用的是非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，以保持GFP的天然活性，利用熒光對其進行追蹤。此外，實驗中用國產(chǎn)的HRP標記的蛋白A取代第二抗體，以節(jié)省費用。蛋白A是從細菌分離的一種能識別多種動物IgG的蛋白，在許多場合它都可以作為第二抗體的替代物。同樣是為了節(jié)省費用，實驗中用醋酸纖維素膜（AC膜）代替硝酸纖維素膜（NC膜），這樣要便宜得多，而效果卻無大差別。

第一部分：GFP抽提物在非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳，除試劑中不含SDS及蛋白樣品不加熱處理外，其余的與SDS-PAGE幾乎相同。因為要做免疫印跡，電泳結(jié)束后，凝膠不染色，而是做轉(zhuǎn)移電泳。

[儀器、材料和試劑]
(一)儀器與器材
1．垂直板電泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．電泳儀
3．微波爐
4．小型高速離心機
5．專用紫光燈（BIO-RAD公司）
6．槍，槍頭，1.5mL 離心管
(二)材料
1．蛋白樣品：GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀
(三)試劑
1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8
2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8
3．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放。
4．10％Ap (-20℃存放)
5．2x 非變性膠樣品緩沖液：
0.125 mo1／L Tris·HCl pH6.8
20％ 甘油
0.01％ 溴酚藍
6．5x電極緩沖液
Tris 7.5g
G1y 36 g
雙蒸水溶解，定容至500mL，使用時稀釋5倍使用

[實驗操作]
1．裝配做膠用的玻璃板"三明治"：
2．做膠：先配制濃度為12％的分離膠，配方如下：

雙蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
TEMED 10 μL
10％AP 100 μL
總體積 10 mL （剛好灌制兩塊膠）

灌分離膠膠后在膠面上加水封，等膠自然凝聚后（此時在膠面與水封之間可見清晰的界限），開始配制4％的濃縮膠，配方如下：

雙蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
TEMED 5μL
10％Ap 30μL
總體積 3.0 mL （夠做兩塊板的濃縮膠）

灌濃縮膠、插1mm的梳子。待濃縮膠凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加樣孔之間的間隔發(fā)生扭曲，用注射器的針頭小心加以整理。
3．非變性凝膠電泳蛋白樣品的制作：在GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀中加2x 非變性膠樣品緩沖液100微升，用槍頭吹打，使沉淀溶解，將樣品液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，12000r/m離心3分鐘，取上清液加樣。
4．瓊脂封底：做好膠后，把玻璃板"三明治"從架子中取出，將兩玻璃板之間的硅膠夾條去掉，用2%融化的瓊脂填滿膠底的空隙，注意不要產(chǎn)生氣泡。
5．電泳槽組裝：封底后將玻璃板"三明治"凹玻璃面向內(nèi)重新裝到"提籃架子"上，固定好后，將整個部件放到電泳槽的外殼中，然后加電極緩沖液。
6．加樣：取蛋白溶液離心后的上清液加樣，加成一個梯度，即每一泳道的加樣量依次減半。
7．電泳：先將電壓調(diào)到80V，當(dāng)樣品進入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓使恒定在150V。當(dāng)溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，關(guān)掉電源，停止電泳。
8．將玻璃板從電泳槽中取出，小心地用舊的電話卡撬開兩玻璃板，小心地用塑料牙簽將凝膠從玻璃上剝離下來，使凝膠貼在事先準備好的一張比膠面略大的濾紙上。操作時要徐緩，小心不要把膠弄破。


第二部分：免疫印跡染色

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器與器具
1．電泳儀(要求為大電流低電壓)
2．電泳轉(zhuǎn)移槽及轉(zhuǎn)移夾
3．水平搖床
4．小塑料盒
5．鑷子
6．搪瓷盤
(二)材料
1．醋酸纖維膜
2．濾紙
3．一次性塑料手套
(三)試劑
1．轉(zhuǎn)移電泳緩沖液
25mmo1／L Tris，192mmo1／L 甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3
6.05gTris + 28．83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L
2．PBS貯存液(10xPBS)
0.2mo1／L 磷酸緩沖液，PH＝7.4，含8.7％ 的NaCl
3．PBS緩沖液：10xPBS貯存液用重蒸水10倍稀釋
4．封閉液：PBS + 5％脫脂奶粉
5．漂洗液：PBS + 0.2％Triton X-100
6．麗春紅染色液：4％三氯醋酸，1％麗春紅
7．一抗：兔抗GFP血清，用PBS適稀釋50-100倍
8．辣根過氧化物酶標記的蛋白A (HRP-pA)
9．DAB顯色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4-7.6）中，然后加入50微升的0.5％的過氧化氫。顯色液不穩(wěn)定，要在臨用前配制。

[實驗操作]（接第一部分的實驗操作8往下做）
1．將醋酸纖維素膜（AC膜）事先裁成比需要轉(zhuǎn)移的凝膠塊略大的小塊。
2．在搪瓷盤中加入轉(zhuǎn)移電泳緩沖液，將AC膜在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中浸泡，使完全浸透。同時把兩塊海綿也在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中浸透。
3．將轉(zhuǎn)移夾打開，置搪瓷盤中，在有黑色標記的一半上放上一塊已浸透了轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的海綿，把貼在濾紙上的凝膠塊濾紙面向下放在海綿上，在轉(zhuǎn)移電泳緩沖液中使AC膜緊貼在凝膠上，切勿使AC膜與凝膠間留有氣泡。再把一張濾紙浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一塊海綿。將轉(zhuǎn)移夾合上，夾緊，做成“三明治”。
4．轉(zhuǎn)移電泳槽中放入轉(zhuǎn)移電泳緩沖液，將“三明治”夾放入，使凝膠塊（即黑色的一面）朝向負極，AC膜朝向正極，切勿放錯方向，否則蛋白將跑到溶液中，而不是轉(zhuǎn)移到膜上。
5．接通電泳儀電源，使電流達到100-150mA，電泳轉(zhuǎn)移過夜。
6．轉(zhuǎn)移電泳完畢，將轉(zhuǎn)移“三明治”夾從轉(zhuǎn)移電泳槽中取出，將夾子打開，用鑷子捏住AC膜的一角，將AC膜有蛋白的一面朝上放在一塊干凈的濾紙上。于暗處在紫光燈下，仔細觀察發(fā)綠色熒光的條帶的位置，用鉛筆點一些點子，標出它。
7．將AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中，加麗春紅染液10-20mL，染色3分鐘，用蒸餾水輕輕漂洗數(shù)次至背景紅色消失。這時應(yīng)該可以看到轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白條帶。
8．傾去漂洗的蒸餾水，在小塑料盒中加入封閉液10mL，室溫下于脫色搖床上緩慢振蕩1小時。
9．倒出封閉液（棄去），用PBS洗一次，加PBS稀釋的一抗溶液5mL，室溫下緩慢振動3小時或過夜。
10．取出AC膜，用PBS漂洗液洗3次，每次5分鐘(手搖或脫色搖床上振蕩)。
11．放入HRP標記的蛋白A溶液中，在室溫下于脫色搖床上緩慢振動3小時或更長時間。
12．取出AC膜，用漂洗液洗滌，方法同10。
13．加入DAB顯色液5mL，輕輕晃動，顯色數(shù)分鐘或更長的時間，直到黃褐色的條帶清晰可見，加入蒸餾水漂洗幾次，洗去顯色液，終止反應(yīng)。注意主要的顯色條帶是否與事先用鉛筆標記的位置相重合。
14. 將AC膜夾在兩張干濾紙中間，將水分略微吸干，然后掃描或拍照，記錄實驗結(jié)果。



實驗十 非變性條件下GFP的制備聚丙烯酰胺凝膠電泳

[實驗原理]
制備電泳與普通的分析電泳在原理上沒有什么不同，只是用的凝膠厚些、加的樣品量大些罷了。因為制備電泳的膠厚，電泳時有個散熱問題，電泳后還有把所要分離的蛋白從膠中洗脫下來的問題。為了提高制備電泳的效率，有些公司（如BIO-RAD）生產(chǎn)了專為制備電泳設(shè)計的電泳槽。我們的實驗用非變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳制備GFP，在整個的電泳過程中GFP始終維持其天然活性。電泳結(jié)束后，不用染色處理，在紫光照射下可以很容易地將發(fā)綠色熒光的GFP條帶從凝膠上切下來。

[實驗操作]
1、用1.5毫米夾條的玻璃板做膠，分離膠的濃度仍為12%，注意用不含SDS的非變性系統(tǒng)緩沖液配膠，配濃縮膠時也同樣。
2、做濃縮膠時不加梳子，而是做分離膠那樣用水封頂，使?jié)饪s膠的頂部形成一平面。
3、制備電泳的蛋白樣品與前次免疫印跡的相同，用非變性的樣品緩沖液做樣，樣品不加熱處理。上樣前要充分離心(1.5mL離心管，12000rpm，5分鐘），勿使所加樣品中含有沉淀。
4、上樣量0.2-0.4mL，上樣后要使樣品的高度在整個濃縮膠面上均勻分布。
5、在樣品完全走進濃縮膠前電流不要調(diào)得過大，以免樣品發(fā)熱，產(chǎn)生明顯的對流。待樣品完全走進濃縮膠后可以加高電壓，但不要超過150V，以防過熱。
6、電泳結(jié)束后，取下并打開玻璃板“三明治”，在紫光燈下用刀片將發(fā)綠色熒光的條帶從膠上切下，切成小段，放于干凈的1.5mL離心管中，冷凍保存。

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DNA 指紋技術(shù)（DNA fingerprinting）

一一、 主要儀器與試劑
儀器：水浴鍋、恒溫搖床、暗合、X光片、同位素操作屏蔽設(shè)備、暗室洗片設(shè)備、尼龍膜、吸水紙
試劑：1、ACD液的配制： 檸檬酸 0.48 g
檸檬酸鈉 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至100ml，高壓滅菌
2、SET的配制：1 M Tris-Hcl (PH8.0) 2.5 ml
250 mM EDTA-Na2 (PH8.0) 25ml
5 M Nacl 5ml
加入ddH2O至250ml , 高壓滅菌
3、蛋白酶K：10mg蛋白酶K + 1ml ddH2O, 充分溶解后，-20℃保存
4、20%SDS： SDS 5g 加入ddH2O 定容至50ml
5、1M Tris-Hcl (PH8.0)：
121.0g Tris + ddH2O 至800ml溶解，用純的HCL調(diào)節(jié)PH 8.0 定容1 L。（滅菌）
6、0.5 M EDTA-Na2 (PH8.0)
EDTA-Na2 186.1g +800 ml ddH2O于磁力攪拌器上溶解，用NaOH調(diào)節(jié)PH 8.0，定容1 L.。（滅菌）
7、5M Nacl溶液
29.22g Nacl +80 ml ddH2O 溶解后，定容100ml。（滅菌）
8、5×TBE緩沖液
54g Tris + 27.5g 硼酸+20 ml 0.5M EDTA (PH8.0)+800ml ddH20 , 定容 1 L。
9、設(shè)計的內(nèi)切酶（含有各種的Buffer）
10、瓊脂糖、HCL、NaOH
11、50*TAE
242g Tris + 700ml ddH2O 溶解，+100ml 0.5M EDTA(PH8.0)+57.1的冰醋酸；定容1L。
12、10*BPB
0.2M EDTA，20%聚蔗糖，0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚蘭
13、變性液
1.5mol/L Nacl ,0.5mol/L NaOH
14、雜交液
100g SDS + 50ml蒸餾水加熱溶解厚后，
在加入10ml 10*blotto(至終濃度為1*blotto ,1%脫脂牛奶，0.02%疊氮鈉)，
5ml 20*SSC(至終濃度為 1*SSC) +35ml蒸餾水
15、20*SSC
175.3gNacl + 88.2g檸檬酸鈉 + 800ml ddH2O,用濃的NaOH調(diào)節(jié)PH7.0之后，定容1L。滅菌


二、實驗步驟
1、基因組DNA的制備（方法同RAPD技術(shù)）
2、基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切（反應(yīng)條件可根據(jù)試劑要求變化）
（1） 在一個新的干凈的1.5ml的離心管內(nèi)加入以下的成分：8~10 ug DNA , 1ul 酶（10U以上），2ul 10*Buffer ,2ul 40 mmol/L 三氯亞精胺，補加滅菌的雙蒸水至20ul。
（2） 在內(nèi)切酶的適宜溫度下反應(yīng)足夠的時間。
（3） 取出酶切的樣品于4℃下保存?zhèn)溆谩?br> 3、制備瓊脂糖凝膠和酶切產(chǎn)品的電泳
（1）使用TAE緩沖液制備0.8%的瓊脂糖凝膠（大膠用，2cm厚度，約用300ml）。
（2）向酶切樣品加入1/10體積的10*BPB，充分混勻。（上孔加樣，記住加入DNA Marker）
（3） 加樣（5~10min）后，20V恒壓電泳48h左右。
4、進行Southern轉(zhuǎn)移
(1) 電泳完成后，將凝膠連同作膠板一起放入一個 方型的塑料盒內(nèi)，倒入500ml的0.2mol/LHcl處理25~30min.間斷性搖動混勻（5min/次）。
（2）倒掉稀鹽酸溶液，加入滅菌的雙蒸水洗滌一下凝膠，倒掉水；加入500ml的變性液浸泡30min, 間斷的搖動。
(3)倒掉變性液，加入500ml 0.5倍的稀釋變性液（0.75mol/L Nacl ,0.25mol/L NaOH）浸泡20min，間斷的搖動。
(4)將凝膠移到一塊干凈的玻璃板上,切掉凝膠多余的無用部分,將已經(jīng)裁剪好的尼龍膜平鋪在凝膠表面(先在0.5的變性液中浸泡),用玻棒輕輕壓其表面趕走氣泡.
（5）將三張稍大于膜的濾紙放于膜上，每放一張就應(yīng)用玻棒將其表面的氣泡趕走（濾紙應(yīng)先在0.5的變性液中浸泡）。
（6）將一打（約4~5cm厚的）吸水紙放在濾紙上,在將一塊玻璃板放在吸水紙的上面,壓緊兩塊玻璃板迅速翻轉(zhuǎn),并去掉膠面上的玻璃.
（7）在膠面上放置三張較凝膠大的濾紙（先于0.5倍的變性液內(nèi)處理），并用玻棒輕輕的趕走氣泡。（為了防止上下的濾紙相互接觸，可先用保鮮膜在剛翻轉(zhuǎn)時將外露的濾紙和吸水紙封?。?br> （8）將整個的裝置用保鮮膜封好（防水分的蒸發(fā)），并壓上一塊玻璃板；持續(xù)轉(zhuǎn)移6~8h，取出尼龍膜放在2*SSC中浸泡20min ,然后放在一張濾紙上烘干，即可備用。
5、隨機引物法標記小衛(wèi)星探針


6、預(yù)雜交、雜交、洗膜
（1）將預(yù)熱的雜交液（60℃）倒入塑料盆中，將待雜交的膜一張張的放入雜交液。恒溫（60℃）搖床震動6h左右。
（2）將標記的放射性探針于沸水中處理5~10 min以變性DNA，然后迅速取出插入冰中。
（3）將尼龍膜取出，按5*105cpm/ml的濃度加入變性的探針，緩慢的搖勻，然后將膜重新放入雜交液中，恒溫（60℃）搖動15h。
（4）將膜取出放入1*ssc 溶液中室溫洗滌5min，然后轉(zhuǎn)入洗膜液中（1*SSC、.1%SDS）于（60℃）洗滌30min 更換洗膜液重復(fù)一次。
（5）將膜放入1*SSC于室溫下洗滌5min。取出平鋪于干燥的濾紙上，待倒無水珠時，用保鮮膜包好備用。
7、放射自顯影（具體根據(jù)暴光盒決定）
（1）在暗室內(nèi)打開X光暴光盒，加入一張增感屏，X光片放在膜上，另一張增感屏光滑面朝下放在X膠片上，蓋緊盒子，放入-70℃放射自顯影暴光。
（2）暴光完成后，在暗室洗片，X光片在顯影液中12min，1.5%冰醋酸溶液（停顯液）中10S，再裝入定影液中5min，最后放入流水沖洗20min，晾干后即可分析。

牧童

謝謝版主!!!!