枯草芽孢桿菌系統(tǒng)總結

kiroco

枯草芽孢桿菌芽孢桿菌屬的一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產菌；有的菌株具有強烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產菌的親株或制取5'-核苷酸酶的菌種。在遺傳學研究中應用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15-20g瓊脂能耐氧化；耐擠壓；耐在快速繁殖過程中，產生大量多種維生素、有機酸、氨基酸、蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C溫度下能存活20分鐘芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當先用一弱堿性染料，如孔雀綠（malachitegreen）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。

（1）將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6％）染10分鐘。

（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

（5）用番紅水溶液復染1分鐘，水洗。

（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色?！吭趐H為5.5~8.5時生長良好，最適生長溫度為37°

一、目的要求

1、學習分離、純化噬菌體的基本原理和方法。

2、學習噬菌體效價測定的基本方法。

二、基本原理因為噬菌體是專性寄生物，所以自然界中凡有細菌分布的地方，均可發(fā)現(xiàn)奇特異的噬菌體的存在，亦即噬菌體是伴隨著宿主細菌的分布而分布的，例如糞便與陰溝污水中含有大量大腸桿菌，故也能很容易的分離到大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，也容易分離到乳酸桿菌噬菌體等。由于噬菌體侵入細菌細胞后進行復制而導致細胞裂解，噬菌體即從中釋放出來，所以，（a）在液體培養(yǎng)基內可使混濁菌懸液變?yōu)槌吻?，此現(xiàn)象可指示有噬菌體存在；也可利用這一特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)，使噬菌體增殖、釋放，從而可分離到特異的噬菌體；（b）在宿主細菌生長的固體瓊脂平板上，噬菌體可裂解細菌而形成透明的空斑，稱噬菌體斑（圖1），一個噬菌體產生一個噬菌斑，利用這一現(xiàn)象可將分離到的噬菌體進行純化與測定噬菌體的效價。本實驗是從陰溝污水中分離大腸桿菌噬菌體，剛分離出的噬菌體常不純，如表現(xiàn)噬菌斑的形態(tài)、大小不一致等，然后再進一步純化。噬菌體的效價就是1毫升培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。效價測定的方法，一般應用雙層瓊脂平板法。由于含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，一個噬菌體產生一個噬菌體斑，因此，能進行噬菌體的計數(shù)。

三、器材37℃培養(yǎng)18小時的大腸桿菌斜面，陰溝污水；本實驗均用普通肉膏蛋白胨培養(yǎng)基500毫升三角瓶內裝三倍濃縮的液體培養(yǎng)基100毫升，試管液體培養(yǎng)基，瓊脂平板，上層瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂0.7%，試管分裝，沒管4毫升），底層瓊脂平板（含培養(yǎng)基10毫升，瓊脂2%）大腸桿菌18小時培養(yǎng)液，大腸桿菌噬菌體10-2稀釋液（用肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基稀釋）0.9毫升液體培養(yǎng)基的小試管含4支，肉膏蛋白胨瓊脂平板（10毫升培養(yǎng)基，2％瓊脂，作底層平板用），含4毫升瓊脂培養(yǎng)基的試管（0.7％瓊脂，作上層培養(yǎng)基用）5管，滅菌小試管5支，滅菌1毫升吸管10支，48℃水浴箱等。滅菌吸管，滅菌玻璃途布器，滅菌蔡氏細菌濾器，滅菌抽濾器，恒溫水浴箱，真空泵等。

1、噬菌體的分離（1）制備菌懸液取大腸桿菌斜面一支，加4ml無菌水洗下菌苔，制成菌懸液。（2）增殖培養(yǎng)于100ml三倍濃縮的肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，加入污水樣品200ml與大腸桿菌懸液2ml，37℃培養(yǎng)12～24小時。（3）制備裂解液將以上混合培養(yǎng)液2500r/min離心15分鐘。將以滅菌的蔡氏過濾器用無菌操作安裝于滅菌抽濾瓶上，用橡皮管連接抽濾瓶與安全瓶，安全瓶再連接于真空泵（如圖2）。圖上的真空表接或不接均可。將離心上清夜倒入濾器，開動真空泵，過濾除菌。所得濾液倒入滅菌三角瓶內，37℃培養(yǎng)過夜，以作無菌檢查。（4）確證試驗經(jīng)無菌檢查沒有細菌生長的濾液作進一步證明噬菌體的存在。（a）于肉膏蛋白胨瓊脂平板上加一滴大腸桿菌懸液，再用滅菌玻璃涂布器將菌液涂布成均勻的一薄層。(b)待平板菌液干后，分散滴加數(shù)小滴濾液于平板菌層上面，里37℃培養(yǎng)過夜。如果在滴加濾液處形成無菌生長的透明噬菌斑，便證明濾液中有大腸桿菌噬菌體。

2、噬菌體的純化（1）如果已證明確有噬菌體的存在，便用接種環(huán)取菌液一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基內，再加人0.1毫升大腸桿菌懸液，使混合均勻。(2）取上層瓊脂培養(yǎng)基，溶化并冷至48℃（可預先溶化、冷卻，放48℃水溶箱內備用）,加入以上噬菌體與細菌的混合液0.2毫升，立即混勻。(3）并立即倒人底層培養(yǎng)基上，混勻。置37℃培養(yǎng)12小時。(4）此時長出的分離的單個噬菌斑，其形態(tài)、大小常不一致，再用接種針在單個噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌體，接入含有大腸桿菌的液體培養(yǎng)基內。于37℃培養(yǎng)。（5）等待管內菌液完全溶解后，過濾除菌，即得到純化的噬菌體。（以上（1)(2)(3）三步驟，目的是在平板上得到單個噬菌斑，能否達到目的，決定于所分離得到的噬菌體濾液的濃度和所加濾液的量，最好在做無菌實驗的同時，由教師先做頂備試臉，若平板上的噬菌體連成一片，則需減少接種量（少于一環(huán)）或增加液體培養(yǎng)基的量；若噬菌斑太少，則增加接種量。以免全班同學重做）。

3、高效價噬菌體的制備剛分離純化所得到的噬菌體往往效價不高，需要進行增殖。將純化了的噬菌體濾液與液體培養(yǎng)基按l:10的比例混合，再加入大腸桿菌懸液適量（可與噬菌體濾液等量或1/2的量），培養(yǎng)，使增殖，如此重復移種數(shù)次，最后過濾，可得到高效價的噬菌體制品。

4、噬菌體是效價測定（1）稀釋噬菌體（a）將4管含有0.9毫升液體培養(yǎng)基的試管分別標寫10-3，10-4，10-5和10-6。(b)用1毫升無菌吸管吸0.1毫升10-2大腸桿菌噬菌體，注入10-3的試管中，旋搖試管，使混勻。(c)用另一支無菌吸管從吸0.1毫升10-3大腸桿菌噬菌體，注入10-4的試管中，旋搖試管，使混勻。余類推，稀釋到10-6管中，混勻，如圖所示。（2)噬菌體與菌液的混合（a）將5支滅菌空試管分別標寫10-4，10-5，10-6，10-7和對照(b）用吸管從10-3噬菌體稀釋管吸0.1毫升加人10-4的空試管內，用另一支吸管從10-4稀釋管內吸0.1毫升時加人10-5空試管內，如圖1直至10-7管。(C）將大腸桿菌培養(yǎng)液搖勻，用吸管取菌液0.9毫升加人對照試管內，再吸0.9毫升假如10-7試管，如此從最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9毫升大腸桿菌培養(yǎng)液。（D）將以上試管旋搖混勻。（1）將5管上層培養(yǎng)基融化，標寫10-4，10-5，10-6，10-7和對照，使冷卻至48℃，并放入48℃水浴箱內。（2）分別將4管混合液和對照管對號加入上層培養(yǎng)基試管內。每一管加入混合液后，立即旋搖混勻。（3）混合液加入上層培養(yǎng)基中（4）接種了的上層培養(yǎng)基倒入底層平板上(a）將旋搖均勻的上層培養(yǎng)基迅速對號倒入底層平板上，放在臺面上搖勻，使上層培養(yǎng)基鋪滿平板。(b）凝固后，放置37℃培養(yǎng)(5)觀察平板中的噬菌斑將每個稀釋度的噬菌斑數(shù)目記錄于實驗報告表格內，并選取30-300個噬菌斑的平板計算算每毫升未稀釋的原液的噬菌體數(shù)（效價）。噬菌體效價=噬菌斑數(shù)x稀釋倍數(shù)x10常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂

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