飼料酶制劑應(yīng)用效果的評價體系
馮定遠(yuǎn) 左建軍 （華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 510642）
酶制劑應(yīng)用效果的評價不像一般的營養(yǎng)成分或添加劑那樣相對容易。許多時候，即使酶制劑是有效的，是有針對性的，但未必能夠在動物的生產(chǎn)性能中反映出來。酶在動物日糧中應(yīng)用更多的是表現(xiàn)出生產(chǎn)性能指標(biāo)或試驗數(shù)據(jù)差異不顯著，在這種情況下，僅僅用傳統(tǒng)的動物生產(chǎn)性能指標(biāo)（生長增重和飼料報酬）評價方法并不能完全反映酶的作用及其效果，必須建立綜合評價體系。一般地，這種評價體系可以考慮包括如下幾個方面：1）酶制劑活性的評定；2）酶制劑穩(wěn)定性的評定；3）酶制劑應(yīng)用主要生產(chǎn)性能評定；4）酶制劑應(yīng)用效果的非常規(guī)評定等。其中酶制劑活性的評定是最基本的評價方法，也是非飼料用酶的評價方法。這里重點討論與飼料用酶有關(guān)的其他評價方法，有時候，酶制劑應(yīng)用效果的非常規(guī)評定方法往往是體現(xiàn)飼料酶制劑效果的敏感指標(biāo)。 1 酶制劑穩(wěn)定性的評定 1.1 溫度對酶制劑穩(wěn)定性的影響 由于酶是具有一定結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，其活性中心（催化位點）易受到溫度影響而失活變性。溫度對外源酶穩(wěn)定性的影響主要在二方面，其一是酶制劑本身的最適作用溫度；其二是酶制劑應(yīng)用于飼料工業(yè)耐受調(diào)質(zhì)制粒溫度。一般來說，每一種酶制劑都有其最適作用的溫度范圍，超出此范圍則該種酶制劑活性很低或失活。在我們實驗室的試驗通過體外法測定出4種外源酶的最適作用溫度：α-淀粉酶的酶活最高時的溫度是40～60℃，超過70℃，活性降低；木聚糖酶酶活最高時的溫度是30～40℃，大于50℃，酶活降低，超過70℃，則酶失活；β-葡聚糖酶酶活最高時溫度是30～40℃，大于50℃，則酶活急劇下降，超過70℃，則酶失活。說明每一種酶制劑均有其耐溫特性。通常微生物酶比動物體內(nèi)的酶耐高溫，主要原因在于微生物酶來源于菌株發(fā)酵，發(fā)酵過程中的溫度要高于動物體溫。據(jù)安永義（1997）測定，淀粉酶在60℃左右活性最高；于旭華（2001）測定微生物來源的淀粉酶和纖維素酶的最高活性都是在溫度為60℃時取得。與在我們實驗室的試驗的差異主要在于酶的來源不一致，因為不同來源酶的特性是不同的。因此，對于不同來源酶的耐溫特性需采取同一方法測定，便于相互比較。由于酶制劑種類較多，來源不一，有關(guān)其他各種酶的耐溫特性有待于進(jìn)一步研究。 外源酶制劑應(yīng)用于飼料工業(yè)的一個焦點問題是酶制劑在制粒過程中的耐溫性。飼料調(diào)質(zhì)制粒往往有70～90℃的溫度，這樣的溫度有可能使酶發(fā)生變性。以往零星的有關(guān)酶制劑耐溫試驗是在實驗室的烘箱中進(jìn)行的，不能反映飼料生產(chǎn)的真實過程及飼料成分的復(fù)雜性對酶的影響，因而缺乏實際的意義。在我們的試驗中采用實際生產(chǎn)條件，通過溫度的調(diào)控來研究二種來源酶制劑的制粒耐溫性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淀粉酶在制粒溫度不超過85℃仍有較高的保存率；酸性蛋白酶在制粒溫度75℃時酶活保存率在80℃以上；液體發(fā)酵的β-葡聚糖酶和木聚糖酶在制粒溫度為85℃時仍有70%左右的活性。并且試驗證實，液體發(fā)酵的外源酶的耐溫性能要高于固體發(fā)酵的外源酶，原因主要在于對液體發(fā)酵的各種外源酶可以根據(jù)其耐溫性能進(jìn)行穩(wěn)定化處理，而固體發(fā)酵的酶制劑則難以做到這一點。安永義（1997）用大麥-豆粕日糧混入經(jīng)耐溫處理的干酶制劑，在75℃、85℃、95℃下，調(diào)質(zhì)30秒再制粒發(fā)現(xiàn)，調(diào)質(zhì)溫度在85℃對酶活性無任何影響；另一組試驗表明，干酶制劑品在85℃以上調(diào)質(zhì)15分鐘仍有一定活力，而95℃則有一定影響。
1.2 pH值對酶制劑穩(wěn)定性的影響 各種酶制劑都有其最適pH值。如果一種酶制劑具有較寬的保持高活力的pH值范圍，同時又適應(yīng)動物體內(nèi)消化道內(nèi)環(huán)境的pH值，那么這種酶就能發(fā)揮好的作用。在沈水寶（2002）的試驗中發(fā)現(xiàn)淀粉酶在pH值5.0～7.0，酸性蛋白酶在pH值2.5～4.6；木聚糖酶在pH 5.5～7.6；β-葡聚糖酶在pH值6.0～7.5都有較高的活性，而根據(jù)Makkink等（1994）報道，豬十二指腸至空腸的pH值平均為6.4，胃內(nèi)平均為3.0，說明上述四種酶能在豬的胃腸道發(fā)揮作用。同時，酶制劑在一定pH值條件下酶性很低或根本測不出活性。如木聚糖酶和β-葡聚糖酶在胃內(nèi)條件下即pH＜4.0時，檢測不到活性，而在pH＞5.5的條件下又表現(xiàn)出活性；同樣，酸性蛋白酶在pH2.5～4.6時表現(xiàn)出較高的活性，而在pH＞6.0時則活性很低。說明酶制劑能在動物消化道內(nèi)一定位點保持活性并起到消化作用。 不同來源的酶制劑對pH值的穩(wěn)定性存在差異。鄭祥建、韓正康（1998）用三種β-葡聚糖酶的測定結(jié)果表明：Biokyowa β-葡聚糖酶和國產(chǎn)Ⅱ號最pH值是5.0，pH 4～6范圍內(nèi)有較高水平的酶活力；國產(chǎn)Ⅰ號β-葡聚糖酶最適pH是3.5，在pH 3.5～4.5活力較高。在我們實驗室的試驗測定β-葡聚糖酶最適pH值為6.0，pH 6.0～7.5之間維持較高的酶活力水平。因此，應(yīng)根據(jù)酶制劑pH值的穩(wěn)定性及其對動物消化道內(nèi)環(huán)境pH值的適應(yīng)性進(jìn)行選擇和使用，才能獲得較好的效果。
1.3 離子濃度對酶制劑穩(wěn)定性的影響 飼料被豬采食后，在胃的酸性條件下（pH=1.5～3.5）和小腸弱酸性條件（pH=6.0）均要停留一段時間，在這樣的環(huán)境中，外源酶的加入可能與其中的無機(jī)離子之間發(fā)生相互作用，從而影響酶活性的發(fā)揮。劉強(qiáng)（1998）用體外法研究了α-淀粉酶與各種無機(jī)離子之間的關(guān)系，結(jié)果表明：α-淀粉酶隨Ca2+濃度（2.5～320mmol/L）升高而上升，隨Zn2+濃度（0.1～2.5mmol/L）、Fe2+濃度（0.2～4.0mmol/L）和Mg2+濃度（5.0～20mmol/L）升高而降低，其中，隨Zn2+濃度變化幅度大于Fe2+ 和Mg2+，Mg2+對淀粉酶活性的影響最小。在我們實驗室的試驗采用體外法對豬飼料含量較高的二種離子Ca2+和Cu2+離子對三種外源酶（ α-淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡聚糖酶）活性的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：鈣離子濃度（2.5～160mmol/L）對各種酶的活性沒有影響；隨著銅離子濃度增加（2.5～160mmol/L），α-淀粉酶的活性降低，銅離子濃度大于40mmol/L時，檢測不出α-淀粉酶的活性；β-葡聚糖酶的活性隨銅離子濃度增加而顯著降低，當(dāng)銅離子濃度大于20mmol/L時，活性很低。說明銅離子可以使α-淀粉酶和β-葡聚糖酶失活。酸性蛋白酶表現(xiàn)出完全相反的結(jié)果，其活性隨Cu2+濃度增加而升高，Cu2+（5.0～160mmol/L）范圍內(nèi)，其活性是對照組的二倍。飼料進(jìn)入動物消化道后，經(jīng)消化道分解之后，其成分相當(dāng)復(fù)雜。就酶制劑而言，其與特定底物、無機(jī)離子等之間會存在競爭關(guān)系，因而研究無機(jī)離子對酶活性的影響還必須注意到酶與底物、酶與無機(jī)離子之間的競爭關(guān)系，因而離子濃度對酶活的影響及重金屬對酶活的影響還有待于進(jìn)一步的研究加以證實。
1.4 內(nèi)源蛋白酶對酶制劑穩(wěn)定性的影響 外源酶一般是由微生物培養(yǎng)而來的一種具催化活性的蛋白質(zhì)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。當(dāng)外源酶進(jìn)入動物消化道后是否受到內(nèi)源蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）的作用，也是外源酶穩(wěn)定性的因素之一。鄭祥建（1998）用胰蛋白酶對三種β-葡聚糖酶的消化作用表明：胰蛋白酶會分解β-葡聚糖酶，但作用2小時仍可保持77.1%的活力。孫建義等（2002）體外模擬動物胃腸道條件研究里氏木霉GXC的β-葡聚糖酶對內(nèi)源蛋白酶的耐受性，結(jié)果表明：雖然β-葡聚糖酶在胃內(nèi)活性較低，但能在小腸中恢復(fù)，同時，胃蛋白酶和胰蛋白酶對β-葡聚糖酶無降解作用。在我們實驗室的試驗中，體外模擬動物胃腸道條件研究胃蛋白酶和胰蛋白酶對各種外源酶（α-淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶）的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：α-淀粉酶不能耐受胃蛋白酶的作用，果膠酶會受到胃蛋白酶的分解，酸性蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶對胃蛋白酶的耐受性較好，其中β-葡聚糖酶穩(wěn)定性最好，纖維素酶被胃蛋白酶的損失率為8%左右，而酸性蛋白酶在2小時之前的損失率為2%，4小時的損失率達(dá)到16.2%。說明各種酶在胃蛋白酶的作用下會有一定程度的損失。動物消化道內(nèi)胃蛋白酶的分泌量會受到日糧成分、采食、及應(yīng)激等因素的影響，同時各種外源酶進(jìn)入到消化道內(nèi)會跟各自的底物發(fā)生作用。體外法研究證明：酸性蛋白酶和纖維素酶對胰蛋白酶的耐受性好，而α-淀粉酶在溫育的60分鐘和120分鐘酶活損失較大；果膠酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶對胰蛋白酶的耐受性隨著溫育時間的增加，酶活性有所降低。說明胰蛋白酶會對各種外源酶有一定程度的降解。同樣地這種降解的程度會受到動物消化道內(nèi)胰蛋白酶濃度和各種酶作用底物濃度的影響。
2 酶制劑在動物中應(yīng)用效果的一般評定方法 2.1 消化試驗及代謝試驗測定營養(yǎng)物質(zhì)消化率和代謝率的評定 采用全收糞法，進(jìn)行代謝試驗比較酶對各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響是常見的一種酶制劑應(yīng)用效果評定方法。在于旭華（2004）的試驗中，在小麥基礎(chǔ)日糧中添加木聚糖酶對黃羽肉雞表觀代謝能和能量表觀代謝率都有升高的趨勢，組Ⅱ～組Ⅺ比對照組提高2%～7%，比Hew等（1998）提高的幅度有所降低，這主要與本試驗所采用的日糧的能量濃度較高有關(guān)，日糧能量濃度較高時，木聚糖酶對日糧能量提升的空間較小，而如果日糧的能量濃度較低，則木聚糖酶對日糧能量提升的空間較大。Carré等（1992）的試驗表明，日糧添加阿拉伯木聚糖酶提高了動物的AME，其中淀粉消化率的提高貢獻(xiàn)率為35%，而脂肪和蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)率分別為35%和30%。Hew等（1998）在小麥日糧中添加2種阿拉伯木聚糖酶后，結(jié)果日糧中各種氨基酸在糞中的消化率由平均0.70分別提高至0.78和0.79，將日糧氨基酸回腸末消化率由平均0.78分別提高至0.84和0.85。Steenfeldt等（1998）報道，在3周齡肉雞小麥基礎(chǔ)日糧中添加酶制劑，可以提高糞中蛋白的表觀消化率和脂肪的表觀消化率，同時也將回腸蛋白和脂肪的表觀消化率分別提高6%和13%。在于旭華的試驗中，添加木聚糖酶對日糧中粗蛋白的真消化率也有不同程度的提高。
2.2 飼養(yǎng)試驗測定動物常規(guī)生產(chǎn)性能的評定 飼養(yǎng)試驗是動物營養(yǎng)試驗中最常用、最直接、有時候也是最有效的效果評定方法，酶制劑在日糧中應(yīng)用效果的評定也不例外。的確，任何的營養(yǎng)措施和配方技術(shù)，最終必須要反映在動物飼養(yǎng)的生產(chǎn)效果，反映在動物生產(chǎn)性能（生長性能、增重性能、產(chǎn)奶性能、產(chǎn)蛋性能等等）上，大量的酶制劑在飼料和養(yǎng)殖中應(yīng)用的報道都反映了這種情況，也是目前絕大多數(shù)人評價和判斷飼料酶有效性的依據(jù)，這種評價和判斷不僅在生產(chǎn)實踐上，同樣也在科學(xué)研究上。一般常用的動物生產(chǎn)性能評定指標(biāo)是狹義上的動物生產(chǎn)性能指標(biāo)（為了方便，我們可以把狹義上的動物生產(chǎn)性能指標(biāo)稱為“常規(guī)動物的生產(chǎn)性能指標(biāo)”），主要包括動物生產(chǎn)水平（生長水平、增重水平、產(chǎn)奶水平、產(chǎn)蛋水平等）及其相應(yīng)的飼料效率（飼料報酬、耗料增重比、料肉比、餌料系數(shù)等）。這方面的報道特別多，這里不作更多的討論。
3 酶制劑應(yīng)用效果的非常規(guī)評定方法 3.1 體外模擬法測定的評定 體外模擬法是評價酶制劑品質(zhì)的有效方法之一，體外法能夠在一定程度上反映酶制劑的作用效果，并與體內(nèi)結(jié)果有較強(qiáng)的一致性。Petterson等（1989）報道，運用體外法能夠反映出木聚糖酶和β-葡聚糖酶在黑麥和小麥日糧中NSP的水解情況。Graham和Lowgern等（1991）利用體外消化法對β-葡聚糖酶對雞麥類日糧體內(nèi)外代謝能消化率回歸方程的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果說明利用體外法能夠反映出β-葡聚糖酶在麥類日糧中的作用效果。Bedford等（1993）研究表明，利用體外法可以對體內(nèi)小腸食糜的粘性情況進(jìn)行預(yù)測，并能夠用來估測在肉仔雞日糧中添加微生物酶制劑促進(jìn)生長的能力。Smulikowska等（1992）進(jìn)行了7種商品酶制劑對黑麥作用的體內(nèi)外對比研究，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和體外降低食糜粘性最有效的酶制劑種類是一致的，建議在酶制劑的應(yīng)用中使用簡單的體外模擬法進(jìn)行檢測。Alloui等（1994）和Simbaya等（1996）在酶制劑對菜籽粕NDF和ADF降解情況的研究中也得出同樣的結(jié)論。Zhang等（1996）使用對數(shù)線性模型體外評價酶制劑的效率，從而預(yù)測酶制劑在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用效果。體外法不僅可以快速評定酶制劑的作用效果，也為酶制劑作用機(jī)理的研究提供了一種研究手段。Tervil?等（1996）體外模擬肉仔雞對小麥的消化，結(jié)果證明，添加細(xì)胞壁降解酶后飼料細(xì)胞壁被破壞，大部分蛋白質(zhì)被釋放出來。因此，利用體外模擬法來研究纖維素酶在 家禽上的作用效果，以此來解釋其作用機(jī)理也是可行的方法。Zyla等（1995）提出的體外模擬家禽嗉囊、胃和小腸消化的方法是目前較多采用的方法。在黃燕華（2004）的試驗中，即采用Zyla等（1995）的方法對纖維素酶分解纖維飼料的效果及作用機(jī)理進(jìn)行了探討。體外試驗的結(jié)果與體內(nèi)試驗有較強(qiáng)的一致性。
3.2 應(yīng)用“加酶日糧ENIV值”的評定 添加酶制劑對飼料原料的有效營養(yǎng)改進(jìn)（ENIV系統(tǒng)）的核心是各種飼料原料在添加特定酶制劑的情況下，可提供額外有效營養(yǎng)量，即ENIV值，ENIV值更直接的作用是在配方設(shè)計時考慮更能顯示出酶制劑添加的功效，因為在營養(yǎng)水平高的情況下，酶制劑的動物生產(chǎn)效果可能顯示不出來。有效營養(yǎng)改進(jìn)值ENIV也可以用于設(shè)計專用酶制劑產(chǎn)品，如果大量的研究和應(yīng)用已經(jīng)得到一組飼料原料使用相應(yīng)酶制劑的ENIV值，其它生產(chǎn)酶制劑產(chǎn)品的廠家設(shè)計新的酶制劑所選擇單酶的種類及其活性單位時，可以根據(jù)ENIV值作為一個重要的參照指標(biāo)確定酶譜及其有效活性。有關(guān)這方面的內(nèi)容可參考 馮定遠(yuǎn)和沈水寶（2005）的專門討論。
3.3 應(yīng)用“非常規(guī)動物生產(chǎn)性能指標(biāo)”的評定 我們必須注意到，一方面，目前酶制劑作為一種爭論比較多的添加劑，在實際應(yīng)用時，很難達(dá)到理想的效果，許多時候反映出兩點：一是生產(chǎn)性能指標(biāo)的改善往往并不達(dá)到生物統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平；二是生產(chǎn)性能的效果并不穩(wěn)定。動物生產(chǎn)性能并不僅僅是狹義上的生產(chǎn)水平和飼料效率，廣義的動物生產(chǎn)性能指標(biāo)還應(yīng)該包括其他指標(biāo)，甚至還包括不能量化的指標(biāo)（我們可把狹義上以外的其他動物生產(chǎn)性能指標(biāo)稱為“非常規(guī)動物的生產(chǎn)性能指標(biāo)”），如外觀表現(xiàn)、健康狀況、整齊度、成活率、同時出欄的比例等等。動物生產(chǎn)性能不僅僅包括動物的生物學(xué)方面的性能，還應(yīng)該包括養(yǎng)殖方面的商品性能、綜合經(jīng)濟(jì)價值等。這些方面特別容易被忽視，也許這些容易被忽視的性能指標(biāo)恰恰是更能反映酶制劑這種復(fù)雜、變異和多功能的添加劑的效果。所以，我們認(rèn)為，除了一般常規(guī)的評價方法外，有時候需要其他的非常規(guī)評定方法，這是建立多層次的飼料酶制劑及其應(yīng)用效果的評價體系的意義所在。例如，已經(jīng)證實未消化的可溶性纖維是影響非特異性結(jié)腸炎綜合癥的關(guān)鍵因素，尤其是對于采食小麥基礎(chǔ)日糧（顆粒飼料）的體重為15～40 kg的豬（Taylor，1989）。日糧中添加適宜的木聚糖酶可以改善這種癥狀（Hazzledine和Partridge，1996），對于已經(jīng)受到影響的，可以減少粉狀飼料的需要量或者重新評估配方的成本。其他的研究也有用酶制劑降低日糧性腹瀉的類似報道，尤其是斷奶仔豬更明顯（Inborr和Ogle，1998；Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998）。未來的 養(yǎng)豬生產(chǎn)中抗生素的使用只能是策略性的而不是日常性。上述這些報道，以及酶與治療或亞治療劑量的抗生素的具有可能的協(xié)同作用的報道（Florou-Paneri等，1998；Kantas等，1998；Gollnisch等，1996），將為實現(xiàn)未來的養(yǎng)豬生產(chǎn)方式提供非常令人感興趣的可能性。這時候，使用酶的價值就不能僅僅看增重了。
這里特別要指出，許多的實踐經(jīng)驗表明，酶制劑在動物生產(chǎn)中應(yīng)用具有如下幾方面不被重視的表現(xiàn)：一是對日糧組成不十分合理或者配方技術(shù)水平不高時，應(yīng)用有針對性的高效酶制劑可以在一定范圍內(nèi)，達(dá)到調(diào)整和平衡的作用；二是在飼料原料質(zhì)量比較差和不穩(wěn)定的情況下，適當(dāng)?shù)拿钢苿┛梢赃_(dá)到改善和緩和的效果；三是使用高質(zhì)量的酶制劑可以提高動物生長增重性能的均一度和外觀的整齊度。這三方面的表現(xiàn)之間既有關(guān)聯(lián)，也不完全相同，但都直接與養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)。生長增重性能的均一度可以通過量化指標(biāo)反映出來，例如，離均差的大小可考慮作為評價酶在動物日糧中應(yīng)用的輔助指標(biāo)，甚至是重要的評定指標(biāo)。也許，這類非常規(guī)動物生產(chǎn)性能指標(biāo)不僅僅可作為酶制劑效果的評定指標(biāo)，同樣可以作為其他飼料添加劑和營養(yǎng)因素的效果的評價指標(biāo)，在動物營養(yǎng)科學(xué)朝著精細(xì)化、數(shù)據(jù)量化的方向發(fā)展的趨勢下，越來越多人意識到其重要意義。
4 小結(jié) 外源酶的作用效果，許多試驗得出的結(jié)果并不一致，有些結(jié)果顯著，而另一些試驗顯示了改善的趨勢，但效果不一定顯著。對這些觀察結(jié)果，有許多可能的解釋。一般情況下，由于酶的種類、活性以及酶的添加水平不同，很難對不同的試驗進(jìn)行直接比較。即使酶的活性確實（固定的、穩(wěn)定的），可是酶單位及測定酶活性的方法的差異并不總是恒定不變的。飼料酶制劑和應(yīng)用條件的復(fù)雜性，決定了酶應(yīng)用效果評價不能僅僅靠常規(guī)的評定方法，而必須通過多種評定方法的結(jié)合，有時候其他的評定方法更能反映出酶的作用效果，特別是在一般生產(chǎn)指標(biāo)未達(dá)到顯著水平時更是如此。因此，建立和推廣飼料酶制劑及其應(yīng)用效果的評價體系十分必要。
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